产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板
产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定-定稿
产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定摘要：试验中的真菌一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。
包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌对其进行了微生物纯化、分离、筛选、酶活的测定及复核鉴定等。
关键词：纤维素酶活筛选真菌 ITS 鉴定纤维素是自然界存在量最大的一类天然资源，且可无限再生。
麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。
并且我国每年产秸秆约7亿多吨，实现秸秆资源高效利用，是我国可持续发展面临的重要问题。
能源危机和环境危机是整个人类社会目前面临的严峻问题，而合理有效的处理和利用纤维素资源将为解决这些问题提供一种有效的手段。
本实验通过对菌种产纤维素酶活的测定确定其酶活高低，并综合形态观察和ITS序列分析对其进行鉴定。
1.材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种试验菌种一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。
包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌，所有菌种均来源于中国农业微生物菌种中心（ACCC）。
1.1.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基马铃薯200.0g 葡萄糖20.0g 琼脂15.0~20.0g蒸馏水1000.0mL pH 自然马铃薯去皮，切成块煮沸30.0min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000.0mL羧甲基纤维素培养基（CMCNa）NH4NO3 1.0g KH2PO4 1.0g KCl 0.5g Mn SO4 0.004g ZnCl20.0017g CoCl20.002g MgSO4•7H2O 0.5g FeSO4 0.01g CMCNa 10g 琼脂20g 蒸馏水1000ml pH 6.5羧甲基纤维素液体培养基（同羧甲基纤维素固体培养基配方，不加琼脂）液体发酵培养基玉米秸秆粉（40目）10.0g 麸皮 2.5g KH2PO4 1.5g (NH4)2SO4 1.3g K2HPO4·3H20 2.9g CaCl20.15g MgCl2 1.0g FeSO4 0.005g MnSO40.0061g NaCl 1.0g 蒸馏水1000 mL1.1.3主要试剂1.0%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：2g羧甲基纤维素钠（粘度300~600里泊）溶于200.0mL蒸馏水中，水浴加热至溶解，用一层纱布过滤，取滤液100.0mL加pH4.8的醋酸盐缓冲液20.0mL，再加蒸馏水410.0mL，贮冰箱备用。
紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力
紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力张君胜;张力;张尧【摘要】为筛选产纤维素酶酶活力高的菌株应用于秸秆饲料发酵,利用紫外线诱变对1株产纤维素酶绿色木霉菌进行了试验研究.结果表明:筛选出1株纤维素酶产酶量高且性状稳定的高产菌株ZJUV18,其发酵72h纤维素酶滤纸酶活达68.07 U/g,较原始菌株提高4.45倍.%A Trichoderma viride strain was treated with ultraviolet to screen out a high cellulase-producing strain and apply in straw feed fermentation. The results showed that a high cellulase-producing strain with high cellulose yield and stable characteristics, which was named ZJUV18, was screened out. The FPA could be up to 68. 07 U/g after fermented for 72 hours, which was 4. 45 times the activity of the original strain.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)010【总页数】3页(P125-127)【关键词】纤维素酶;诱变;紫外线;酶活力【作者】张君胜;张力;张尧【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】S182粮食短缺、能源危机是目前全球所面临的危机。
而我国由于受人口多、耕地少的双重制约，粮食供应形势尤为严峻。
因此，我国畜牧业要稳定持久发展，就必须减少对粮食的依赖[1]。
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究⼴西轻⼯业GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY2009年7⽉第7期（总第128期）⾷品与⽣物纤维素是地球上分布最⼴，含量最丰富的碳源物质，对⼈类⽽⾔，它⼜是⾃然界中数量最⼤的可再⽣资源，是永不枯竭的⽣物资源。
纤维素可被纤维素酶降解⽣成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应⽤是植物质资源再利⽤的主要途径。
微⽣物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，迄今为⽌，国内外共记录了产纤维素酶的菌株⼤约53个属的⼏千个菌株[1]，其中主要有细菌、放线菌和真菌，⽬前研究的最清楚的是霉菌中的⾥⽒⽊霉T.reesei 。
细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，⼤多数对结晶纤维素⽆降解活性，且所产⽣的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度[1]，因此对细菌的研究较少。
但由细菌产⽣的纤维素酶⼀般为中性或碱性，近⼗年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤、纺织等⽅⾯应⽤前景⼴阔，细菌纤维素酶制剂已显⽰出良好的应⽤性能和巨⼤的经济价值[2]。
我们从青藏⾼原牦⽜粪中分离到⼀株⾰兰⽒阴性菌Ti-bet-YD4600-2，经16S rDNA 序列⽐对分析，Ti-bet-YD4600-2为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.)菌株。
鞘氨醇单胞菌属是Yabuuchi （1990）[3]等通过研究16S rDNA核苷酸序列，胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q 的主要类型，确定的⼀个新属，该属细菌具有着极强的⽣命⼒，分布⼴泛，对除草剂、偶氮染料、多环芳烃等具有较好的降解作⽤，近年来受到⼴泛重视和研究[4]。
１材料和⽅法1.1材料来源通天河（34°49.753N,92°56.142E ）海拔4604m 处取牦⽜粪样品。
1.2培养基[5]分离平板培养基，复筛培养基，滤纸崩解实验培养基，液体摇瓶培养基。
1.3初筛取样品1g 置于装有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶中，摇匀，从三⾓瓶中取1mL 转移到另⼀盛有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶，在25℃和150r /min 下振荡培养2h ，取0.1mL 振荡培养液涂布筛选到以CMC 为唯⼀碳源的培养基平板，倒置恒温25℃培养3~4d ，注意观察菌的⽣长情况，挑取单菌落⽤斜⾯保存。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。
常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。
2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。
3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。
二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。
常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。
2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。
3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。
三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。
2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。
3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。
4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。
综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。
通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。
产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定
种类繁多 ， 来源也很广 。大多数纤维 素酶 主要来 自 微 生物 体 心 。 目前 ， 们 对 各 种 微 生 物 （ 括 真 菌 ］ 人 包 和细菌 ） 的纤 维 素 酶 的关 注 较 多 ， 其 是 源 于 真 菌 尤 的纤维素酶 。所有能分解微 晶纤维素 的真菌 ， 能 均 或 多或 少地 分泌 纤 维 素 酶 ， 以纤 维 素酶 的真 菌 源 所
本 研究 使用 羧 甲基 纤维 素 液体 培养 基 富集 培 养 环境 样 品 ， 分离 得到 ３ 产 纤维 素酶 的霉菌 。使 用 ４株 刚果 红染 色 初筛 和 Ｄ Ｓ法 复筛 ， 到 ２株纤 维 素 酶 Ｎ 得 活较 高 的霉 菌菌 株 ｗ０ ０ 、 ｘ０ ５ 同时还 使 用 苏 ｘ５ ３ ｗ ｌ０ 。
℃培养 ４ —５ ｄ进 行 活 化 ， 后 接 种 到 ３ Ｌ（ ５ 之 ０ｍ ２ ０
ｍＬ三角瓶 ） Ｄ Ｐ Ａ液体 培养 基 中 ， ２ ℃ 、８ ／ ｉ 于 ８ １０ｒｒｎ ａ 下 摇床 发酵 ， ３ｄ后 取 样 测 定 上 清 发 酵 液 中 的 Ｃ ＭＣ
酶 活力 。
１ ５ ＤＮ ． Ｓ法测 Ｃ ＭＣ酶 活
—
ｆ ｕ ｅｈｌｓ ｏ ｒｃ ｌ ａ ｅ—ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｆ ｎ ｉｓ ａｎ ｒ ｓ ｌ ｔｄ ｔ ｒ ｕ ｈ ｅ ｒ ｈ ｎ ｕ ｔ ｒｎ ｙ ＣＭＣ —Ｎａ ｌ ｕ ｄ ｍｅ ｉ ｍ． ｒ ｄ ｃ ｎ ｇ ｔ ｉ ｓｗｅ ｅ ｉｏａ ｅ ｈ ｏ ｇ ｎ ｃ ｍｅ ｔｃ ｌ ｉ ｇ ｂ ｕ ｒ ｉ ｕ ｉ ｉ ｄ ｕ ｑ
Ｄ Ｉ１．９９ｊ ｉ ｎ １０ － ８ ．０ １０ ．０ Ｏ ： ３６／．ｓ ．０ ９ ８ １２ １．３０２ ０ ｓ ４
产耐热纤维素酶菌株的筛选及其酶学性质研究
2 . 2 . 5 金属离子对酶活的影响。在酶反应体系中, 分别加 入不同浓度的各种金属离子溶液, 混合, 反应 30 m in , 测定酶 活, 结果见图 5。由图 5可知, 金属离子对酶活有一定的影 响, 具体表现为 Cu 、 M n 对酶活 有一定的激 活作用, 而 Mg 、 Zn 对酶活有一定的抑制作用。
心 15 m in, 上清液即为粗酶液。 1 . 2 . 3 酶活的测定。取 pH 值 5. 0的 1 00% 柠檬酸 CMC Na 缓冲液 1 . 0 m ,l 加入酶液 0 . 5 m ,l 40 水浴 30 m in, 在此条件 下, 1 h由底物生成 1 m ol葡萄糖所需的酶量定义为 1个酶 活力单位 ( U /m l); 采用生物传感器测定还原糖含量 1 . 2 . 4 菌种的鉴定。菌种采用试剂盒鉴定。 2 结果与分析 2 . 1 菌种的分离筛选结果
安徽农业科学, Jou r n al ofAnhu iAgr.i Sc. i 2010 , 38( 7 ): 3331 - 3332
责任编辑
姜丽
责任校对
张士敏
产耐热纤维素酶菌株的筛选及其酶学性质研究
游庆红,Байду номын сангаас尹秀莲
(淮阴工学院生命科学与化学工程学院, 江苏淮安 223001)
摘要 [ 目的 ]筛选产耐热纤维素酶菌株, 并对其酶学性质进行研究 。 [ 方法 ] 分离筛选产耐热纤维素酶的菌株, 并用菌种鉴定试剂盒进 行鉴定。 对产耐热纤维素酶的菌株的酶学性质进行研究 。 [ 结果 ] 从江苏淮安土壤中分离出 1株产耐热纤维素酶的细菌 , 将其命名为 H 3, 经菌种鉴定试剂盒初步鉴定为枯草芽孢杆菌。该酶最适反应温度为 60 , 最适反应 p H 值为 5 . 5 , Cu2+ 、 M n2+ 对酶活性有一定的激 2+ 2+ 活作用, M g 、 Zn 对酶活性有一定的抑制作用。 [ 结论 ] 该研究为降低纤维素酶生产成本以及推动生物质乙醇的发展提供了科学依 据。 关键词 纤维素酶 ; 细菌; 枯草芽孢杆菌 ; 酶学性质 中图分类号 Q 814 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2010) 07- 03331- 02 Screening of Strains Producing Therm ophilic C ellulose and R esearch on Its Enzym atic Character istics YOU Q ing hong et al ( College of L ife Sciences and Che m ica lEng ineering , H uaiy in Institute of T echnology , H ua ian, Jiangsu 223001) A bstract [ Ob jective] The research a m i ed to screen the strains produc ing ther m oph ilic cellulose and study its enzy m atic characteristics . [M ethod] The strains produc ing ther m oph ilic cellu lose were identified by stra ins identification ki. t T hen its enzym atic characteristics were studied . [M ethod] A bacterium produc ing ther m ophilic ce llulose was separated fro m H ua ian s so il of Jiangsu Prov ince , wh ich w as nam ed as H 3 and w as identified as Bacillus subtilis by strains identification ki. t The optm i al reaction tem pera ture and pH va lue o f the enzym e was 60 2+ 2+ 2+ 2+ , 5 . 5. Cu andM n could activate its enzym e activ ity , whileM g and Zn could reduce enzy m e activity . [ Conc lusion] The study can prov ide the sc ientific basis for reduce the production cost o f ce llulose and pro m o te the developm ent of bio m ass alcoho.l K ey w ords Cellulose ; Bacterium; Bacillus sub tilis ; Enzy m a tic characteristics
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【摘要】通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料.采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定.结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).%In order to provide bacteria for development of cellulase preparations and cellulase engineering,the high-yield cellulase bacteria strains were screened.Separate cellulase producing strains isolated from cow or sheep dung and putrid maize straws or wood chips with Congo red plate to screen cellulase producing strains through the determination of enzyme activity with DNS assay,and observe its shape,dyeing and cultural characteristics.16S rDNA universal primers were applied to amplify genomic DNA of the strain,and to identify the species of rescreening strains.The result indicated that the isolated 16 bacterial strains with higher cellulase production were gram positive,short rod and central spores.In which,10 strains were Bacillus subtilis,6 strain were Bacillus amyloliquefaciens.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】6页(P7-11,19)【关键词】纤维素酶;16SrDNA;分离;鉴定;枯草芽孢杆菌;解淀粉芽孢杆菌【作者】吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【作者单位】甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q939.99随着世界经济的快速发展，能源需求量急剧上升，为了实现可持续发展，世界各国均在寻求新的替代能源，如风能、核能、太阳能、生物质能等等。
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定
本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。
目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。
采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。
因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。
关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (1)1.2.1 实验材料 (1)1.2.2 实验仪器 (1)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (3)2.3 复筛 (3)2.4 酶活的测定 (3)2.4.1原理 (3)2.4.2溶液配制 (3)2.4.3实验步骤 (4)第3章实验结果 (6)3.1 标准曲线的绘制 (6)3.2 菌株复筛结果 (6)3.3 测定纤维素酶活力结果 (7)结束语 (8)参考文献 (9)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
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本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。
目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。
采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。
因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。
关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (1)1.2.1 实验材料 (1)1.2.2 实验仪器 (1)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (3)2.3 复筛 (3)2.4 酶活的测定 (3)2.4.1原理 (3)2.4.2溶液配制 (3)2.4.3实验步骤 (4)第3章实验结果 (6)3.1 标准曲线的绘制 (6)3.2 菌株复筛结果 (6)3.3 测定纤维素酶活力结果 (7)结束语 (8)参考文献 (9)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。
1.2 实验仪器及试剂1.2.1 实验材料土样取自湖南省长沙市岳麓山上、中南大学校本部草地15—20cm深处；1.2.2 实验仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等；1.2.3 培养基（1）培养基A、纤维素富集培养基（1L）：NaCl 6g，MgSO4 0.1g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.1g，(NH4)SO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，琼脂1.5%，CMC-Na 0.5%，pH调至7.0。
B、纤维素筛选培养基（1L）：在上述纤维素酶富集培养基中加入酵母粉1g。
C、马丁培养基：葡萄糖1g,蛋白胨0.5g，KH2PO4~3H2O0.1g，MgSO4~7H2O0.05g，0.1%孟加拉红溶液0.33mL，琼脂1.5g，蒸馏水100mL，自然ph，2%去氧胆酸钠溶液2mL（预先灭菌,临用前加入），；链霉素溶液10000u/mL 0.33mL（临用前加入）。
（2）溶液A、刚果红染色液：用蒸馏水溶解刚果红,终浓度为0.1%(w/v)。
B、刚果红脱色液:终浓度为1mol/L的NaCl溶液。
第2章实验步骤2.1 采样培养（1）采样：在事先勘察好的取样地土壤15-20cm，取3个点采样；（2）溶解：将3份土样各10g加入带有玻璃珠的锥形瓶并溶于无菌水中，在摇床上以200r/min振荡30min；（3）富集：配制100m L 富集培养基中，加入250mL锥形瓶中，取生理盐水中振荡的土样溶液上清取5mL加入富集培养基中，30℃200r/min，培养24h；（4）稀释：梯度稀释10-1mol/L、10-2 mol/L、10-3 mol/L、10-4 mol/L,10-5 mol/L、10-6 mol/L。
2.2 初筛初筛：选取10-5mol/L、10-6mol/L两个浓度梯度各0.1mL分别做3个平行，涂布于纤维素富集培养基平板上，30℃恒温培养箱中培养2d。
挑取生长良好的形态大小不同的菌落于纤维素液体富集培养基中30℃200r/min，培养24h。
2.3 复筛（1）复筛：用接种针将分离到的菌株活化后点种于纤维素筛选培养基平板上,30℃恒温倒置培养2d。
用0.1%刚果红染色液浸染再用1mol/LNaCl溶液脱色5min。
若菌株产纤维素酶,则会在菌落周围出现清晰的透明圈,依据透明圈直径与菌落直径的比值大小选择产酶菌株（2）将筛选获得的产纤维素酶的菌株接种到马丁培养基中，30℃培养4d,能在该培养基中生长良好的为真菌,不能生长的为细菌。
2.4 酶活的测定2.4.1原理纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将3，5-二硝基水杨酸(DNS)中的硝基还原为氨基，生成棕红色的氨基化合物。
在一定的浓度范围内,还原糖的量与棕红色的深浅呈正比关系。
可用比色法测定。
2.4.2溶液配制（1）CMC-Na底物溶液的配制浓度1% 热水煮ph 4.5（2） DNS的配制总量为250ml配方称取3，5-二硝基水杨酸(2.5±0.1 g)，置于约150mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，在再依次加入酒石酸钾钠50g、苯酚(重蒸)0.5g 和无水硫酸钠1.25g，待全部溶解澄清后，冷却至室温，用水定容至250mL，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。
否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。
且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50摄氏度。
（3）3.200mL 0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液 ph 4.5（4）酶活定义1mL液体酶在指定温度50 ，pH=4.5，每分钟水解CMC-Na底物，产生相当于1μg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以ug/mL*min表示。
简写为CMC-Na。
2.4.3实验步骤（1）绘制葡萄糖标准曲线葡萄糖标准液浓度10mg/mLA、向25mL容量瓶中按下表加入相应体积的葡萄糖储液。
B、取0.5mL各个浓度的葡萄糖标准溶液，再加入3mL DNS试剂混匀，沸水浴10min后终止反应，定容至25mL，在540nm处测定吸光度。
每管取3个平行样。
C、所得平行吸光度取均值，对应葡萄糖标准液浓度，吸光度为横坐标，葡萄糖质量为纵坐标作图，作线性拟合，得到葡萄糖标准曲线。
（2）空白管的测定：同DNS法，将0.5mL酶液改成0.5mL缓冲液（3）制备粗酶液A、取发酵液1mL 8000r/min 常温离心10min，取上清液为粗酶液；B、取粗酶液依次稀释至10-1mol/L、10-2 mol/L、10-3 mol/L。
（4）DNS法测酶活力参照DNS法，取0.5mL稀释后的酶液，加入到2mL的CMC-Na底物缓冲液溶液。
50℃水浴反应30min后，立即加入3mLDNS试剂混匀，沸水浴10min后终止反应，冷却后定容至25mL。
在 540nm处测定吸光度，以空白作为对照调零值，每管取三个平行样。
第3章实验结果3.1 标准曲线的绘制3.2 菌株复筛结果3.3 测定纤维素酶活力结果复筛之后测定酶活没有得到预想的结果，分析原因如下：（1）复筛挑选的菌株不准确，培养得到的菌株不是产纤维素酶的菌株；（2）取样地点有限，取样地菌落可能不符合实验要求；（3）稀释梯度太大，富集之后得到的菌株太少；（4）操作过程中无菌不是很严格，可能发生了染菌。
结束语地球上每年生产超过5000亿吨的纤维素，因而纤维素是储藏极为丰富的资源。
它的生产对人类生存环境和可持续发展有着举足轻重的影响。
纤维素酶的微生物的发酵研究主要为菌种的选育以及工艺优化两方面。
实验室规模的纤维素酶生产的研究主要集中于原料预处理和发酵过程。
纤维素酶的生产主要存在酶活力和产酶量不足的问题，运用各种科学方法提高纤维素酶的活力和产量已成为科学研究的重要方面。
当前纤维素酶研究的一个重要课题就是选育新菌株以提高纤维素酶的产量和质量从而达到工业化生产的要求。
万事开头难，第一次实验报告也是如此，实验原理论述长，实验数据处理麻烦，课后思考题做着纠结，牢骚也发了，但还是耐着性子一项一项的完成了。
慢慢地也就没有了那种排斥感，更多的是当做一种习惯，当作实验后的一种总结——把实验时得到的一些简单数字变成说服人的道理。
这次实验对我而言并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。
首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。
一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。
失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。
一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。