从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析
产淀粉酶菌株的分离与纯化
产淀粉酶菌株的分离与纯化一、实验目的和内容目的：掌握用平板稀释法分离得到微生物纯种的方法内容：分离产淀粉酶的芽孢杆菌二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，因此可以从土壤中分离、纯化有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法是常用的方法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等条件，或加入某种底物、抑制剂造成只利于该微生物生长而一直其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落儿获得一种纯培养，获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板技术来完成。
（3）纯化方法：平板划线法，即将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C 区）是逐级稀释的过渡区，第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。
为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D﹥C﹥B﹥A。
三、实验材料1.土样2. 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.5g、蛋白胨15g、NaCl 2.5g、琼脂10g、2%可溶性淀粉10g、无菌水1000ml、PH7.4-7.63.试剂与材料用具：无菌水烧杯、玻璃管、涂布棒、无菌吸管、移液枪、玻璃棒、接种环、无菌培养皿、三角烧瓶、量筒、培养基分装器、天平、药匙、PH试纸、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、棉花、牛皮纸、记号笔，橡皮筋等。
四、实验步骤（一）稀释涂布平板法1.制备培养基2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷至55~60℃时，倒平板。
3.制备土壤菌悬液称取土样10g放入盛有90ml无菌水的烧杯中，搅拌均匀。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从中吸取1ml加入另一支盛有9ml无菌水的试管中，充分混匀，以此类推制成10ˉ1,10ˉ2,10ˉ3,10ˉ4,10ˉ5,10ˉ6不同稀释度的土壤溶液。
产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法注明：蓝色字体是已修改的一、实验目的1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；2、掌握测定酶活力的方法；3、培养自行设计、实施实验的能力。
二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。
待实验前取样即可。
2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。
在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。
4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
三、实验材料1、土壤样品湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。
2、培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液4、玻璃器皿锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种环等四、实验步骤1、样本采集①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定王磊;陈宇飞;杨柳【摘要】从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定.结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4U/mL~10.4 U/mL之间.经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌.%The amylase-producing strains were isolated from soil. After initially screening by starch culture medium, the DNS method was used to determine the total enzyme activity andα-amylase activity of the crude enzyme solution by fermentation extraction. The screened strains were identified through morphological observa-tion and physiological and biochemical reactions. Results showed that:four strains of amylase-producing Bacil-lus were isolated. The ratio of hydrolysis zone diameter to colony diameter was 1.7-3.5. Two strains of them had high amylase-producing activity, which the total enzyme activity reached 19.760 U/mL and 15.432 U/mL. Theα-amylase activity of four strains of Bacillus was 6.4 U/mL~10.4 U/mL. The four strains of Bacillus were authen-ticated that one was Bacillus subtilis, the other three were Bacillus cereus. The ability to produce amylase of Bacillus subtilis was superior to Bacillus cereus.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)006【总页数】4页(P175-178)【关键词】芽孢杆菌;淀粉酶;分离;鉴定【作者】王磊;陈宇飞;杨柳【作者单位】吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507【正文语种】中文淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，是最早实现工业化生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂］等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值，如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。
常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。
其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌122、凝结芽孢。
由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中【4】。
所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1. 了解生物分离提纯的原理和方法技术2. 掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3. 掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4. 培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5. 培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm〜30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少【5】。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
土壤中分离筛选出产淀粉酶的芽孢杆菌方法
可溶性淀粉100g 蒸馏水50L pH7.2
实消:a.投料结束后，启动电机，慢速搅拌。
b.微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹套压力为0.1Mpa左右，待培 养基预热达到95度以上时停止搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀。
c.培养基温度达到95度后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐 内 进气，待罐压升至0.11Mpa后，打开罐面排气阀进行排气。
平皿、超净台、水浴锅、玻璃棒、玻璃球 等 • c.培养基 :牛肉膏2.5g 蛋白胨5g 氯化钠2.5g 可溶性淀粉1g 蒸馏水500ml 琼脂2% pH7.2
2.初筛方案
5g土壤
45ml 无菌 水
玻璃珠
摇床震荡 10分钟
10-1土壤菌悬液
85℃水浴 15分钟
10-2 10-3 10-4 10-5
0.1ml
去上述处理液1mL+DNS试剂2mL沸水浴，取出后迅速冷却+9mL 蒸馏水，摇匀
540nm波长处测其吸光值
上清液+1%淀粉溶液直接加热煮沸+DNS试剂（空白）
表五 DNS法测定发酵液酶活结果
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。
实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。
2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。
3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。
4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。
适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。
一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。
5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。
可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。
6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。
7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。
一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。
根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。
8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。
可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。
9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。
实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。
2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。
3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。
4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。
5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。
总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。
这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。
产淀粉酶的芽孢杆菌的分离和筛选
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定试验一、实验目的1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。
4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。
二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽抱杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。
待实验前取样即可。
2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。
在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
3、芽抱是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽抱最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。
它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。
细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽抱，再在80-90 C温度下杀死菌体，可使芽抱得到富集。
4、芽抱杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25C到75C以上；最低生长温度大约5C到45C；生长最低pH值，从一8到2左右；耐盐范围从低于2%勺NaCI到25%NaC；营养明胶(22°C) 7天内液化1厘米或1厘米以上。
枯草芽抱杆菌和地衣芽抱杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。
5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽抱杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
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土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研【】究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。
常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。
其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。
由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。
所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1．了解生物分离提纯的原理和方法技术2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和【】。
一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源6四、实验材料和用具 4.1 土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和文科楼旁边的桑园内的土壤，以及郭培国老师的种植园内的土壤、演艺中心旁的土壤。
4.2 营养琼脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。
加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。
4.3 淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.5～2.0 校正pH至7.2～7.44.4 发酵培养基(%)：玉米粉 2 黄豆饼粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25K2HPO4 0.2 柠檬酸钠 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.0 4.5 葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.2～7.44.6 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）：蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH7.2～7.44.7 西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02 磷酸二氢铵0.1 磷酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5 琼脂2 溴麝香草酚蓝溶液4 酚红试剂校正pH6.8先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，混匀后分装试管，121℃高温灭菌15min。
4.8 配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH6.8~7.04.9耐盐培养基（%）：①蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠2 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水②蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠10 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水③蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠20 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水④蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠25 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。
加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。
4.10 溶液或试剂染料革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液; 香柏油、二甲苯吲哚试验：乙醚、吲哚试剂V.P.试验：40％NaOH溶液、α-奈酚，淀粉酶活力测定：1%3, 5- 二硝基水杨酸试剂4.11 仪器或其它用具无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿土样三角瓶烧杯洗瓶玻棒试管酒精灯擦镜纸接种环酒精灯载玻片吸水纸等。
恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌箱超净工作台水浴箱紫外灯照射箱磁力搅拌器玻璃珠移液管涂布器显微镜五、实验方法及步骤1、初筛方法①制菌悬液：五个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。
每个环境的土样装1个锥形瓶，共5个，同时将其分为10组，编号ABCDE。
②加热筛选有芽孢的菌：将5个锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液③梯度稀释菌悬液：再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。
取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL 土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。
同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。
在土壤稀释过程中，用相同的移液枪头由浓到稀来稀释。
④涂布平板用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。
每个浓度做3个平板（重复）。
37℃下恒温培养24h。
2、复筛方法【1】划线接种（分区划线法）：在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的单菌落进行分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条，再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（如右图）。
划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~29°C温室中培养约20h.。
再继续分区划线2-3次，以获得较纯的菌种。
将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做染色实验。
3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37℃培养箱中培养24h。
上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室，其他置于无菌室。
实验室里，四个平板均加入碘液，立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透明圈的大小。
根据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的营养琼脂平板上其对应的菌落继续划线接种，培养后将出现的形态特征不一致的菌落进行编号，然后挑取部分出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37℃下培养24h。
否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进行芽孢染色。
筛选出芽孢纯种后进行斜面接种。
革兰氏染色步骤：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。
复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。
镜检：油镜观察染色结果。
芽孢染色染色镜检：·取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。
·于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。
·用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。
加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
·倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
·用石炭酸复红液复染l min，水洗。
·制片干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色，菌体红色。
（注：观察芽孢的形状和位置，查伯杰细菌手册）4.斜面保存菌种·贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。
（每种菌接3管，标上相同编号也要与平板上菌落编号相对应）。
进行斜面接种操作，加塞、包扎好到37℃培养箱里培养24h。
5、菌种的鉴定5.1所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。
然后进行一系列的镜检——革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合附表中芽孢杆菌的指标5.2生理生化试验温度对菌种培养的影响；淀粉水解试验；温度对菌种的影响；明胶液化试验；糖发酵试验；乙酰甲基甲醇试验(V.P试验)；吲哚试验；耐盐性试验；柠檬酸盐利用试验。
·温度对微生物生长的影响将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。
（培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍）取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分别进行标号。