α-淀粉酶产生菌株(细菌)的分离纯化及检测共22页
土壤中产α-淀粉酶菌株的分离和筛选
大理学院学报JOURNAL OF DALI UNIVERSITY 第12卷第10期2013年10月Vol.12No.10Oct.2013［DOI］10.3969/j.issn.1672-2345.2013.10.011α-淀粉酶（α-amylase），编号：EC3.2.1.1，作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，是一种只能催化水解直链淀粉的液化酶〔1〕。
通常采用酶活力（enzyme activity）来表示酶催化一定化学反应的能力〔2〕。
一般情况下，α-淀粉酶的作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度为60~70℃，作用pH值范围5.5~7.0，最适pH值为6.0。
α-淀粉酶主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽孢杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。
α-淀粉酶酶制剂大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，占酶制剂市场份额的25%左右〔3-4〕。
目前，工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶，最常用的方法是从自然界中筛选出可以产这种酶的目的菌种，大致可以分为以下4个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定〔5-6〕。
土壤是微生物生活的大本营，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到期望中的菌株，再对菌株进行发酵培养，生产出所需的酶〔7〕。
由于我国的α-淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，α-淀粉酶酶活力相对于国外同行业的较低〔8〕。
本研究旨在从富含淀粉类物质的土壤中分离纯化出产α-淀粉酶的菌株，通过水解圈直径和菌落直径的比值，结合酶活力大小进行比较，筛选出产酶活力较强的菌株，并对其所产的酶进行初步的酶学性质研究。
研究结果可为α-淀粉酶的生产提供种质资源，同时也为生产实践提供数据支持和理论参考。
1材料土壤中产α-淀粉酶菌株的分离和筛选杨杨，刘毕琴，张发，廖光辉，杨晓燕*（大理学院农学与生物科学学院，云南大理671003）［摘要］目的：从土壤中筛选产α-淀粉酶活力较强的菌株并对其酶学性质进行初步研究。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。
加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。
（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。
（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。
取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
产淀粉酶菌株的分离和筛选
产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。
【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。
淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。
由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。
本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。
通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。
然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。
阿尔法淀粉酶产生菌的筛选
实验7-1 α-淀粉酶产生菌的筛选1目的要求掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种产酶微生物的完整操作步骤。
2实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶它的产生菌广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
本实验利用淀粉与碘的显色反应，采用变色圈法筛选α-淀粉酶的产生菌。
3实验器材3.1 实验材料（1）分离培养基（g/L）蛋白胨10，NaCl 5，牛肉膏5，可溶性淀粉2，琼脂15，pH 7.2。
需注意的是先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中，调匀。
（2）麸曲培养基麸皮7 g，玉米面1 g，（NH4)2SO4 0.04 g（4 %（NH4)2SO4加1 mL）；NaOH 0.08 g（8 % NaOH 加l mL），水10 mL，混合均匀，装入250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌30 min。
3.2 试剂（1）Lugol氏碘液：碘1 g，碘化钾2 g，水300 mL。
配制时先将碘化钾溶于5～10 mL 水中，再加入碘，溶解后定容。
（2）碘原液：碘2.2 %，碘化钾0.4 %，加水定容。
（3）标准稀碘液：取碘原液15 mL，加碘化钾8 g，水定容至200 mL。
（4）比色稀碘液：取原碘液2 mL，加碘化钾20 mg，定容至500 mL。
（5）0.2 % 可溶性淀粉液：称取0.2 g可溶性淀粉，先以少许蒸馏水混合，再徐徐倾入煮沸蒸馏水中，继续煮沸2 min，冷却，加水至100 mL。
（6）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH 6.0：称取Na2HPO4•12H2O 11.31 g，柠檬酸2.02 g，加水定容至250 mL。
（7）标准糊精液：称取0.3 g糊精，悬浮于少量水中，再倾入400 mL沸水中，冷却后，加水稀释至500 mL。
冰箱存放。
3.3 实验仪器小铁铲和无菌纸或袋，无菌水三角瓶（300 mL的瓶装水至99 mL，内有玻璃珠若干），无菌吸管（1 mL、5 mL等），无菌水试管（每支4.5 mL水），无菌培养皿。
淀粉酶的提取-α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chroma togra phy)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromat ograp hy, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Mart in 为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
α-淀粉酶产生菌株(细菌)的分离纯化及检测
1、菌落周围有透明圈 2、菌落粗糙、颗粒感强、 边缘不整齐、有丝状感 （正反面）
32℃培养 24hr
仔细观察 生长菌落
有无透明 圈（有）
选择12个单 菌落，编号
点接于平板 相应区域
加入检测 碘液显色
测量透明圈 和菌落直径
计算D/d比 值（排序）
选择最好 3-4株菌种
划线接种 斜面
培养好后冰 箱保存备用
本次实验基本流程
准备工作 灭菌 制备分离 用平板 冷却99mL 无菌水 加入分离 样品振荡
十倍梯度 稀释涂布 平板分离
培养
菌落计数 挑菌点接 平板培养 测量透明 圈及菌落 直径 需要留下 培养 留于以后 的，挑于 实验用 斜面保存
平板点接检测流程 （尽量不要打开平板，无菌操作）
平板底部 “十字”划 分 四区域对 应编号
第二种 分离和检测用平板培养基 ——300mL/组
可溶性淀粉 30g； Na2HPO4 .12H2O 8g； （NH4）2SO4 4g； NH4Cl 1.5g； 3%豆粕粉浸出液 1000mL 琼脂 20g 121.3℃灭菌20分钟 注：如果还想使用自已组的设计培养基或其它培 养基也可以。 每组200mL培养基制备10个平板。
记录结果 填表计算
1、测量透明圈直径 2、测量菌落直径 3、计算透明圈与菌落直径比值（D/d） 4、根据D/d值大小排序（挑取4株于 斜面培养后备用）
平板菌落计数
总菌落数 计数 有透明圈 菌落计数
记录结果 填表计算
平板放入 冰箱保存
根据碘液 检测结果
挑取单菌 菌于斜面
清洗干净 平板（字）
1、细菌总数 2、产淀粉酶的菌数 3、产淀粉酶菌株占总菌数的比例