淀粉酶产生菌的筛选

实验一淀粉酶产生菌的筛选
及酶活力测定
指导老师：辛树权
生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆
同组人：xx xxx
摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。

我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。

利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。

再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。

关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计
一、实验目的：
1、学习从土壤中分离微生物的方法；
2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法
3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。

二、实验原理：
土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。

将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。

故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。

在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。

淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。

淀粉遇碘呈蓝色。

这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。

随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。

三、实验器材及试剂：
1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园
2培养基：
（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）
（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。

）
（3）摇瓶培养：淀粉培养液。

3、试剂：
碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、
0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。

4、器材：
培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。

四、实验步骤：
1、淀粉产生菌的筛选：
（1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；
（2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒平板备用；
（3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养一天；
（4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中，继续放在37摄氏度培养箱中培养两天；
（5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。

2、酶活力测定：
（1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中，30摄氏度摇瓶培养72h。

（2）酶液稀释：
取发酵液进行4000r/min离心5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。

（3）标准曲线制作：
准备七支试管，按照下表配置混合液。

使用分光光度计策规定各管溶液在660nm下的OD值。

然后以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。

（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合
液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗
的淀粉量。

管号 1 2 3 4 5 6 7（样品）淀粉稀释液/ml 2(0%) 2(0.2%) 2(0.5%) 2(1.0%) 2(1.5%) 2(2.0%) 2(2.0%) 缓冲液/ml 1 1 1 1 1 1 1
40摄氏度水浴保温5min
蒸馏水/ml 1 1 1 1 1 1 0
粗酶液/ml 0 0 0 0 0 0 1
40摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min
稀碘液/ml 1 1 1 1 1 1 1 （5）酶活力测定：
酶活力以每毫升粗酶液在40摄氏度，pH6.0的条件下每小时所分解的淀
粉毫克数来衡量。

五、实验结果：
1淀粉产生菌的筛选：
淀粉产生菌
透明圈
淀粉产生菌透明圈的检验图
2、酶活力测定： (1)实验原始数据： 管号
1 2 3 4 5 6 7 OD
660
0.235
0.584
1.107
1.375
1.788
1.540
（2）标准曲线：
淀粉含量标准曲线图
y = 0.047x R 2 = 0.9779
00.20.40.60.811.21.41.61.820
10
203040
50
淀粉含量mg
O D 值
系列1
线性 (系列1)
（3）计算： 样品的OD 660=1.540
查标准曲线可得：淀粉含量=1.540/0.047=32.766mg
培养基中含有淀粉，淀粉产生菌具有产生淀粉酶的能力，淀粉酶能将培养基中的淀粉分解掉。

当在培养基上滴加稀碘液时，含有淀粉的部分被染为蓝色，而被淀粉酶消耗掉淀粉的部分则表现为不着色的透明圈。

根据透明圈的大小可粗估出不同淀粉产生菌的产淀粉酶能力大小，透明圈越大则产淀粉酶能力越强。

初始淀粉含量=2g/100ml×2ml=0.04g=40mg
被消耗的淀粉含量=40mg－32.766mg=7.234mg
酶活力=7.234mg/(1ml×0.5h)=14.468 mg/(ml·h)
六、实验结果分析：
平板菌落水解圈直径大小受许多因素的影响,例如菌种特性、接种量大小、培养时间、酶的稳定性、温度范围、平板厚度等。

绘制的淀粉含量标准曲线也会受实验室环境影响及误差而造成不准确，酶活力的表示方法也有多种，仅是一个相对的数值。

七、参考文献：
[1]吴根福、杨志坚.发酵工程实验指导.北京：高等教育出版社，2006.
[2] 王弋博,李博,李三相,张海林,金文晶.异淀粉酶产生菌的分离纯化及生长特性. 青海师范大学学报，2003.
[3]王丽丽，仪宏，田庄，李志军. A2淀粉酶产生菌的平板筛选法的研究与改进. 河北轻化工学院学报，1998.
[4]李艳.发酵工程原理与技术.北京：高等教育出版社，2007.
[5]吴燕萍、金其荣、李迅.微生物法生产普鲁兰酶的研究[J ].生物技术,1998，8(6):14-17.
[6]唐蕾.耐热性普鲁兰酶进展[J ].天津微生物,1983.
[7]袁勤生.应用酶学[M].上海:华东理工大学出版社,1994.
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