淀粉酶产生菌的分离
产淀粉酶菌株的分离与提纯
产淀粉酶菌株的分离与提纯摘要：淀粉酶是一种广泛应用于食品、饲料和生物能源领域的酶类。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过营养物质筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
分离出的菌株经过形态学、生化和分子生物学鉴定，最终确定为放线菌属。
通过筛选和优化培养基组成、培养条件、发酵时间等参数，获得了产淀粉酶的高产菌株，其中最高淀粉酶活性达到406.2 U/mL。
随后通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化，纯化后的淀粉酶总回收率为78.5%。
本研究拓展了淀粉酶菌株的来源渠道，并提供了一种有效的产淀粉酶筛选和提纯技术。
关键词：淀粉酶；菌株分离；筛选；纯化Introduction淀粉酶是一种用来加快淀粉转化为葡萄糖片段的酶类，广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸、医药、生物能源等领域。
因此，发现新的产淀粉酶的菌株和提高淀粉酶的产量和纯化度具有很大的应用前景和经济价值。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
随后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化。
Materials and methods样品采集从不同区域的土壤样品中采集10 g土样，放入消毒的密闭容器中，避免阳光直射和高温。
待采集完毕后立即运回实验室处理。
淀粉酶活性测定淀粉酶活性采用Miller方法测定，在37℃下反应15 min后，以0.01mol/L NaOH终止反应，读取吸收度A450。
反应体系为：淀粉溶液 1 mL、哌嗪酸盐缓冲液1 mL、酶液1 mL。
菌株分离取0.1 g土样加入0.9mL 生理盐水中，混合搅拌均匀后，依次向1.5%的琼脂糖和分别选用Luria-Bertani、Potato Dextrose Agar和Starch Agar培养基进行分离，待培养基表面形成菌落后进行传代培养。
通过形态学、生化和分子生物学鉴定，确定产淀粉酶菌株。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
α-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。
淀粉酶产生菌的筛选实验小结
淀粉酶产生菌的筛选实验小结
本实验旨在筛选具有淀粉酶活性的菌株，经过活性药物筛选法，通
过对新鲜海藻类源淀粉酶活性药敏试验结果，用神经酰胺蓝显色法共
分离出了12株具有淀粉酶生成活性的菌株，且12株菌株的淀粉酶活
性均明显优于对照组的淀粉酶活性。
经过16s rDNA分析，结果表明，
这12株菌株属于嗜热及高温嗜热乳杆菌科，包括拟南芥病毒乳杆菌属、干燥乳杆菌属，伯氏乳杆菌属、钝吸乳杆菌属等。
以上结果表明，该
方法高效可靠，可以用于筛选具有淀粉酶活性的微生物菌株，为药物
的开发和应用提供了重要的理论支持。
细菌α淀粉酶产生菌种筛选
1、采样：即采集含菌的样品
1）研究所筛选的微生物得可能分布区域。 2）土壤是微生物的大本营，所以一般采集土样。 3）土壤中，数量上细菌>放线菌>霉菌>酵母菌。 4) 不同区域的土壤含有相应的优势微生物。例如
树林腐土和朽木中纤维素分解菌较多；面粉厂附 近、栽种淀粉质作物土壤中淀粉的分解菌较多； 果实、树叶表面酵母菌较多；蔬菜、牛奶中乳酸 菌较多；油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌 较多等。
2、培养基
1）分离培养基（w/v）：蛋白胨 1%；NaCl 0.5%；牛肉膏 0.5%；可溶性淀粉 0.2%；琼脂1.5%；pH7.2；水定容。 注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到 溶化好的培养基中，调匀。
2）肉膏蛋白胨培养基（w/v）：肉膏蛋白胨培养基：牛 肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%, pH7.07.2
最常用的分离方法是稀释分离法。
4、性能测定
分离得到纯种只是选种工作的第一 步。所分离的纯种是否具有生产上要求 的优良性能，还必须进行性能测定，根 据性能高低进行取舍。
性能测定的方法
1）初筛：一般在培养皿上根据选择性培养基 的原理进行。 例如要筛选淀粉酶产生菌，可以在稀释 分离时使用选择培养基——含淀粉的培养基， 经培养后通过测定透明圈与菌落直径的比 值来衡量淀粉酶活力的高低。
五．实验报告
总结整个分离筛选过程，写出筛 选结果并对筛选结果进行分析。
六. 实验时间安排
周一：配制培养基并灭菌、配制试剂；稀 释分离，37℃培养24h。
周二：碘液检查，挑取透明圈直径：菌落 直径比值大的单菌落，平板划线，37℃ 培养24h。
周三：挑取单菌落接斜面培养基。 周四：接麸曲培养基，37℃培养24h。 周五：测定酶活。
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定生物11.1魏凡棣 37实验目的：对可产生淀粉酶的芽孢杆菌进行分离的测定实验原理：1.传代培养：从土壤中提取微生物，经过一段时间的培养就会大量滋生形成菌落，不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态构造上也有许多明显的反应，而为了保存某种已经获得的菌株，一般采用低温（4摄氏度）抑制微生物的生长，使其保留活性。
2.细胞染色：微生物细胞在碱性，中性及弱酸性溶液中通常带负电，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。
而革兰氏染色则首先用草酸铵结晶紫进行初染，使所有细菌都着结晶紫的蓝紫色；后用卢戈氏碘液媒染增强染料在菌体中滞留能力；后用95%乙醇脱色，由于细胞构造不同革兰氏阴性细菌中碘—结晶紫易洗脱，而经过复染后又被番红染成红色。
3.在显微镜下测定芽孢杆菌的大小：目镜测微尺是一块可放入接目镜内圆形小玻片。
有精准刻度，使用时放入接目镜中隔板上，用以测量经放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，其代表实际长度也不同。
因此，使用前必须校正，以求出在该倍数下每小格所代表的相对长度，后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞实际大小4.芽孢杆菌对淀粉的水解：微生物对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生胞外酶将大分子物质水解才能被吸收利用。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精双糖和单糖。
5.温度对芽孢杆菌生长影响的测定：微生物的生长繁殖受外界环境因素的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，环境条件不适宜时微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。
而不同类型的微生物对温度的适应能力也有所差别。
实验器材：高压蒸汽灭菌锅牛肉膏蛋白胨 NaCl 蒸馏水土样试管培养皿移液管涂布器酒精灯显微镜革兰氏染液载玻片显微镜测微尺二甲苯擦镜纸淀粉‘实验步骤：一、芽孢杆菌的分离纯化：1.取合适量的牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蒸馏水按一定比例配成牛肉膏蛋白胨培养基。
调整PH至7.4到7.6。
产淀粉酶细菌菌株分离
淀粉酶芽抱杆菌的筛1目的了解产淀粉酶细菌的分离和纯化的原理，掌握常用的微生物分离、纯化方法2原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求, 或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
3材料Q A严去甘3.1培养基淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、氯化钠0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉0. 8% 。
3.2 溶液或试剂盛9ml 无菌水的试管，盛99ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶, 制霉菌素母液（抑制真菌）。
3.3 样品土样3.4 仪器或其它用具高压蒸汽灭菌锅、旋涡混合器、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、恒温水浴装置等。
4实验流程倒平板f制备梯度稀释液f涂布（或倾注法）f培养f挑单菌落f保存。
5步骤准备工作：摆好实验材料：将培养基、接种工具和其它用品全部在超净工作台上摆好。
进行紫外线灭菌30min,关闭紫外灯，20-30min后打开照明灯，进行操作。
接种前用酒精棉球将双手消毒。
5.1 稀释平板法①倒平板将淀粉培养基加热溶化待冷至55〜60C时，混合均匀后分别倒平板，淀粉培养基倒六皿三皿用于稀释平板；三皿用于划线分离。
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第四小组
淀粉酶：是指一类能催化分解淀粉分子中糖
苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀 粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉 的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖 单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘 度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇 碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有 较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着 酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小 分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失， 因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为 指标来测定α-淀粉酶的活力。
酶活力测定： （1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养， 将菌溶于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加 入淀粉培养液中，30摄氏度摇瓶培养72h。 （2）酶液稀释： 取发酵液进行4000r/min离心 5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。 （3）标准曲线制作： 准备七支试管，按照下表 配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液在 660nm下的OD值。然后以淀粉浓度为横坐标， 吸光度为纵坐标，做标准曲线。
管号
淀粉稀释液/ml 缓冲液/ml
1
2(0%)
2
2(0.2%)
3
1
4
1
5
2(1.5%)
6
2(2.0%)
7
2(2.0%)
2(0.5%) 2(1.0%)
1
1
1
1
1
40摄氏度水浴保温5min 蒸馏水/ml 1 1 1 1 1 1 0 粗酶液/ml 0 0 0 0 0 0 1 40摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min
试剂：碘液、2%可溶性淀粉、 pH6.0磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙 酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形 瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分 光光度计。 器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工 作台、恒温水浴锅、分光光度计。
实验步骤： 淀粉产生菌的筛选： （1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液； （2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养 基，倒平板备用； （3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉 膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养一 天； （4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中， 继续放在37摄氏度培养箱中培养两天； （5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。
实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤
稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境 中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平 板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微 生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生 淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来 完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培 养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴 碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透 明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌 种产淀粉的能力。
实验器材料及试剂： 材料：河南科技学院花园土壤。 培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基 （牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于 1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至 7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时， 于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀 粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化 钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼 脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～ 7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。
稀碘液/m
1
1
（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照 下表中七号管的要求配置混合液，测得吸 光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓 度，求出被酶消耗的淀粉量。 （5）酶活力测定： 酶活力以每毫升粗酶 液在40摄氏度，pH6.0的条件下每小时所 分解的淀粉毫克数来衡量。
淀粉产生菌的筛选：