产淀粉酶菌株的筛选
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定一实验目的及要求：为了从自然界获得产淀粉酶活力较高的菌株,从面粉、储存面仓、发霉玉米等样品中筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌，并对产淀粉酶菌的生理生化进行了探讨。
从面粉中得到的产淀粉酶菌共有三种，颜色有红色和白色。
从其菌体形态初步了解其特征，随后用唯一碳源实验、葡萄糖酵解实验、过氧化氢酶实验等分析并鉴定其生理生化特性。
二名词定义：淀粉酶分离鉴定淀粉酶 amylase，AMY,AMS一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。
根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
微生物的酶几乎都是分泌性的。
此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。
因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。
另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1,6-键的α-极限糊精。
一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。
β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。
作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。
简答题 设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,并加以必要
简答题设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,
并加以必要
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
土壤中产淀粉酶菌株的分离与鉴定及高活力淀粉酶的筛选
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选组数：第一组组员：王臣东李长花张晓晶杨明明1 实验目的1.1掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
1.2进一步掌握和熟练无菌操作技术。
1.3掌握分离纯化微生物的方法。
1.4掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。
1.5巩固以前学的微生物学实验技术。
1.6学习淀粉酶活性的测定方法。
2 实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
淀粉酶是能够催化淀粉水解，转化成葡萄糖的、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的总称。
从淀粉厂周围采集土壤样品，采用稀释法制备土壤稀释液，涂布于营养琼脂培养基平板上培养1天，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。
然后挑取可产生透明圈的菌株在平板划线培养2-3次，得到纯化的菌株，再测其酶活力大小。
分离得到纯种这只是选种工作的第一步。
所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
性能测定的方法分初筛和复筛两种。
初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。
例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。
复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。
一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。
在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。
3 实验器材3.1样品：土样（甘肃昆仑生化公司周围采集的土样若干）3.2培养基3.2.1平板培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g、琼脂15-20g、自来水1000ml3.2.2斜面培养基：同3.2.13.2.3液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、自来水1000ml3.3 器材：30个90培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台3.4试剂3.4.1 淀粉酶活力测定：碘液3.4.2革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇3.4.3 2%淀粉溶液：2克淀粉加入少量热水使其溶解，再加入热水至100ml4 实验步骤4.1 培养基的制备及其仪器的灭菌4.1.1按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
高产淀粉酶菌株筛选
淀粉酶产生菌的富集培养
①样品采集 用无菌锥形瓶，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约 15g 。 （注意应采取距地表2-3cm以下的土样） ②制备土壤稀释液 称取土样 l0g ，放入盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇 20min ，使土样与水充分混合，将菌分散，即为稀释 10-1 的土壤悬液。取 1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从 此试管中吸取lml加入另一盛有 9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推 制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。 ③涂布平板 取9个筛选培养基，用记号笔在培养皿底部注明稀释度，每种稀释度标记 3 皿，然后用无菌吸管分别由 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、10-6 五 管土壤稀释液中 各吸取0.1ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，用无菌涂布棒在 培养基表面轻轻地涂满整个平面，室温下静置5-10min。 ④培养 将平板倒置在37℃温箱中培养48h。
引起污染。
培养基的制备
④加塞 培养基分装完毕，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界 微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 ⑤灭菌 121℃，20min ⑥搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至 50℃左右，将试管口端搁置在玻棒或其 它合适高度的器具上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 ⑦倒平板 将灭菌后的培养基冷却到55～60℃倒平板。（倒平板的方法是右手
二
原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻 找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。 因此本实验选择从土壤中分离出淀粉酶 高产的菌种，再进行纯培养。主要运用 富集培养技术，稀释涂布平板法和平板 划线分离法及无菌操作技术获得我们所 需要的产淀粉酶菌种。淀粉酶作用于淀 粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而 使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘 的显色反应能力，不再与碘结合，从而 形成透明圈。产淀粉酶菌株在选择培养 基上培养后，会水解淀粉形成水解圈， 加碘液染色后，水解圈尤为明显。
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株筛选
1.淀粉酶产生菌的分离与纯化实验原理淀粉是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键构成的直链淀粉和α-1，6位有分支的支链淀粉组成的。
按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（或异淀粉酶）4大类。
产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等。
利用淀粉遇碘液变为蓝色的特性，将分离的芽孢杆菌（或其他微生物）接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现的透明圈判断该菌是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
实验材料和用具土壤样品或其他富含淀粉质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、淀粉培养基平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等操作步骤分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5 ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种淀粉斜面培养基，再转接淀粉培养基平板，30-32 ℃培养24-48 h。
在平板上滴加稀碘液（或卢戈氏碘液）后测定水解圈直径与菌苔直径的比值。
2）水解圈大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
注意事项1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制。
2）点接淀粉培养基平板时，接种量及接种面积要基本相同。
2. 蛋白酶产生菌的分离与纯化实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。
产淀粉酶(α-淀粉酶)细菌菌株筛选
产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选一、实验目的：1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。
2.巩固以前所学的微生物学实验技术。
3. 3.学习淀粉酶活性的测定方法。
二、实验原理：1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、初步筛选、分离纯化和性能测定。
a)采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。
在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。
例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。
b)初步筛选：i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。
c)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。
纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
d)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
三、实验材料：1.培养基配制：初步筛选:淀粉琼脂培养基2.0g可溶性淀粉，10g蛋白胨，5g牛肉膏，5gNaCl，加少量蒸馏水加热溶解，然后称量16g琼脂加入烧杯中溶化，补蒸馏水至1000mL，再用1mol/L 的NaOH或1mol/L的HCl，调节pH至6.4〔分离培养基：淀粉3.5 %、琼脂粉0.8%、CaCl0.02%、MgSO40.02%、NaCl0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、Na2HPO40.2%、pH7.0。
2.主要试剂和溶液的配制：氢氧化钠溶液中，加入蒸馏水50ml，再加入四水酒石酸钾钠30g，待溶解后用蒸馏水定容100ml，盖紧瓶塞，隔绝CO2。
土壤中产淀粉酶细菌菌株的筛选
土壤中产淀粉酶细菌菌株的筛选张路、彭亚娣、吴亚琴、王思怡、蒲兰琼、陶蕾摘要土壤中含有多种微生物，通过选择培养基可将需要的微生物从中分离出来。
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于不同微生物对营养物质的要求不同，可在培养基中加入或减少某种物质以营造一个只适于所选微生物生长而抑制其他微生物生长的环境，便可淘汰不需要的微生物，分离出所需微生物。
可用平板法分离土壤中产淀粉酶的微生物。
关键词培养基、微生物、分离、平板法（一）引言自然界中各种微生物混杂生长在一起，即使取很少量的样品也会有很多微生物共生在一起。
人们要想研究某种微生物的特性或要确定每种微生物菌株的分类，首先应该对该微生物进行纯培养。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，这几种方法不需要特殊的仪器设备，操作比较简单，一般情况下就能得到比较好的效果。
土壤中含有各种微生物，将含有微生物的土壤制成菌悬液，用十倍递减稀释法稀释后涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，在适宜的条件下培养，待长出菌落后，从各个菌落上挑取单菌种接种到淀粉培养基上，适宜条件下培养，长出菌落后，在各个菌落上滴加碘液，菌落周围如出现无色透明圈，说明淀粉被酶解，即该细菌菌株能产淀粉酶。
我们分离得到产淀粉酶的细菌后可快速高效的生产淀粉酶，以运用到实际生活中，如制淀粉酶片，以助含淀粉酶事物的消化。
（二）人员安排1、包装器材、配培养基（1）配培养基牛肉膏蛋白胨培养基：陶蕾、吴雅琴淀粉培养基：蒲兰琼、王思怡（2）无菌水：彭亚娣、张路（3）包扎：彭亚娣、张路、王思怡、蒲兰琼2、高压灭菌高压灭菌过程中彭亚娣、吴雅琴全程看守，控制阀门的开和关3、制菌悬液、第一次接种（1）取土：陶蕾、吴雅琴（2）配液：王思怡、吴雅琴、张路（3）接种：陶蕾、彭亚娣、吴雅琴、蒲兰琼4、第二次接种（转接）转接:吴雅琴、彭亚娣、王思怡、张路、蒲兰琼、陶蕾5、检测滴定：吴雅琴、彭亚娣、王思怡、张路、蒲兰琼、陶蕾6、结果分析：陶蕾、吴雅琴7、拍照：王思怡、陶蕾、张路8、资料搜集：张路、陶蕾（三）材料与方法1、材料已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏1.5ｇ、蛋白胨2.5ｇ、琼脂10ｇ、NaCl 0.5ｇ、水500ml、pH 7.0～7.2）、已灭菌的淀粉培养基（蛋白胨2.5ｇ、淀粉1.5ｇ、NaCl 0.5ｇ、琼脂10ｇ、pH7.2～7.4）、90ml无菌水一瓶、含9ml无菌水的试管6支、无菌培养皿18个、1ml 无菌移液管、土壤样品、天平、称量纸、试管架、涂布器、500ml烧杯2个等。
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发酵工程实验报告产淀粉酶菌株的筛选姓名：××班级：生物技术学号：××指导老师：×××产淀粉酶菌株的筛选××（长春师范大学生命科学学院生物技术）【摘要】为筛选产淀粉酶的高产菌株, 利用淀粉水解圈作为筛选模型, 从学校附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌。
对其酶活力进行测定, 最终得到产淀粉酶的高产菌株。
【关键词】淀粉酶;水解圈;酶活力;高产菌株Screening of Strains Producing Starch××(Technology of Biological Life Science College of Changchun Normal University)[Abstract] for the high-yield strains were screened for amylase, the starch hydrolysis circle as a model for screening, screening from the school near the soil produced amylase ability of the bacteria. Determination of the enzyme activity, high yield strain eventually produced amylase.[Key words] Amylase;Hydrolysis circle;Enzyme activity;Producing strain前言：生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中, 是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化, 淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50% 以上。
微生物的许多种类都能产生淀粉酶。
淀粉酶种类繁多,特点各异且用途广泛。
因为淀粉酶的用途广泛, 各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260 U /mL左右。
虽然不少微生物能产生淀粉酶,但适合商业生产需要的菌株仍然很少, 在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件。
本文以土壤作为原料, 从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行酶活力测定,使其给工业生产带来经济效益做大量的准备工作。
1. 材料与方法1.1器材①培养皿、量筒、试管、滴管、吸水纸、烧杯、移液管、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、天平、滤纸、pH试纸、试管架、容量瓶等。
②恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、控温摇床、分光光度计、离心机。
③棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、称量纸、试管架、药匙、吸耳球、镊子、酒精棉、废液瓶、胶塞、火柴。
1.2试剂①牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、NaCl、蒸馏水、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、无菌水、95%乙醇、75%酒精、酵母膏、KH2PO4、碘液、淀粉溶液（0.5%）、蔗糖溶液（1%）、3,5—二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、磷酸缓冲液（0.2mol/L,pH6.8）、6mol/L NaOH。
牛肉膏蛋白胨培养基、固体淀粉培养基、种子培养基、发酵培养基。
1.3菌种土壤稀释液2. 操作步骤2.1培养基的配制2.1.1操作流程：称量→溶解→调节pH→分装→加棉塞→包扎→灭菌→摆斜面2.1.2操作步骤：（1）称量药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
（2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。
若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
（3）调pH：用pH试纸检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。
若偏碱，则用１mol/l HCL进行调节。
注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
（4）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。
（5）加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞，以防止外界微生物进入培养基内而造成污染。
（6）包扎：加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。
若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外一层牛皮纸。
然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
（7）灭菌：将上述培养基于121.3℃高压锅内，高压蒸汽灭菌20min。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
所用培养皿、移液管、涂布棒用牛皮纸包扎好，无菌水、试管包扎，一起高压灭菌。
（8）摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2，待其凝固。
2.2 微生物的分离与纯化2.2.1 土样的采集（1）地点选取：长春师范学院第一教学楼西侧家属楼门前菜园中的土壤（潮湿）。
（2）采集时间：2013-3-28,10:30.（3）采集原则：地点选取后，用小铲子除去5cm表土，取离地面5-10cm处的土壤盛与袋中并标明时间、地点及环境情况。
2.2.2 土壤稀释液的制备（1）取10g土壤样品加入装有90ml无菌水的无菌烧杯中，轻轻摇晃混匀，制成菌悬液。
（2）再分别取5只试管，分别加入9ml无菌水。
然后把土壤菌液和5管9ml的无菌水排列好，依次编号1,2,3,4,5及6号管。
（3）在无菌操作条件下，用无菌移液管吸取1ml 10-1浓度（菌悬液）的菌液于装有9ml无菌水的2号管中，摇匀即制成10-2浓度菌液，然后再从2号管中取1ml 10-2浓度的菌液于3号管中，摇匀，依次稀释到10-6，这样就得到了10-1—10-6六个稀释度的菌悬液。
2.2.3 涂布平板（1）倒平板：将配置好并已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，待其凝固。
（2）涂布：分别取10-2—10-6浓度的菌液0.2ml倒入培养皿中，用涂布棒涂匀，做好标记。
2.2.4 培养将标记好的培养皿倒置放入恒温培养箱，37℃恒温培养24小时。
2.3 平板划线分离微生物在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中挑取少量菌样，在淀粉培养基上平板划线分离（如图1），划线的方法多样，目的是获得单个菌落。
图1 平板划线方法2.3.1 初筛：分别挑取培养24h的五个浓度的菌落到淀粉培养基上，按照上述的划线方法分离菌落，目的是获得单菌落。
将划线分离完成的培养皿做好标记，再倒置放入恒温培养箱，37℃恒温培养24小时。
2.3.2 纯化（复筛）：培养24h后取出培养皿，加入少量碘液，观察其透明圈的大小。
挑取透明圈较大的单菌落到新的淀粉培养基上，方法同上。
重复操作2-3次，最后一次记录菌圈的大小。
2.4 菌种保存:将筛选出来的菌圈较大的菌株接到牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基上进行保存。
3.淀粉酶活力的测定3.1 菌种活化：将保存的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24小时，备用。
3.1.1种子液的制备：取一环活化的菌种，接入装量为50ml种子培养基的250ml三角瓶中，37℃,180r/min培养18h。
3.1.2摇瓶培养：分别取1ml种子液，接入盛有50ml发酵培养基的200ml三角瓶中（接种量为2%）。
置摇床中，30℃震荡培养24h，转速为160r/min。
3.2 酶的提取：液体培养基在3000r/min的离心机中离心10min，取上清液。
3.3 淀粉酶活力测定取25ml刻度试管4只，按下表编号并操作，记录实验结果。
表一测定淀粉酶活力表管号试剂（ml） 1 2 3 4pH6.8缓冲液 1 2 1 2蔗糖溶液 1 1淀粉溶液 1 1淀粉酶液 1 1酶促反应摇匀，37℃水浴5minDNS试剂 2显色反应沸水浴5min光密度（D540）4.实验结果与分析4.1 初次培养的细菌：分别为10-2—10-5浓度的菌落（如图2）。
10-210-310-410-510-6图2 初次培养的细菌4.2 初筛菌落（如图3）10-210-310-410-510-6图3 初筛菌落4.3 复筛菌落（如图4）10-210-310-410-510-6图4 复筛菌落4.4 淀粉酶活力的测定表二复筛菌落直径和水解圈直径的结果编号水解圈直径d1（cm）菌落直径d2（cm）酶活力（U/g）1 1.24 0.61 53.42 1.01 0.60 46.33 0.92 0.64 41.74 0.87 0.56 44.65 0.72 0.60 30.43214 5图5 淀粉圈大小图从图中可以看到淀粉圈的大小，即代表了酶活力强弱，淀粉圈越大越明显，说明酶活力越强，反之越弱。
图中1号菌酶活力最强，2、4号菌的酶活力较强，3、5号菌酶活力一般，但相对其他菌活力较好。
5.总结与讨论5.1实验总结本实验的最终目的就是要把自然界土壤中混杂的微生物通过以下步骤完成分离纯化，首先利用牛肉膏蛋白胨培养基培养出细菌，然后在把这些菌群通过划线分离的方法接种到淀粉培养基上，此步的目的是获得能分解淀粉的单个菌落。
最后挑选几个产淀粉能力强的单个菌落中的菌接种到斜面上，进行保种，这样就获得纯净的能分解淀粉的菌落。
5.2讨论5.2.1实验可靠性分析由于实验过程有涉及到无菌操作，所以操作不当或操作方法错误都有可能对实验结果造成影响，使实验结果不准确。
但总体上除去这些外在因素，实验结果还是可靠的。
5.2.2实验中的问题及原因分析○1制备培养基时出现的问题：加热熔解琼脂时液体剧烈沸腾溢出三角烧瓶，导致实验重新进行，浪费了人力物力，由于搅拌不够，出现了糊底的现象。
以后的实验中要引起足够的重视②接种操作时没有尽量避免外界细菌的掺入，使得最后培养得到的菌落可能掺杂了空气中的杂菌，而在灼烧接种环时也有因接种环过热使得一部分菌体被杀死。
③划线时没有严格按照老师的标准，再加上操作不熟练，划的线太过稀疏，分离不明显，未得到太多的单一菌落6.实验注意事项1)称药品的牛角匙不能混用，称完药品后应及时盖紧瓶盖。