淀粉酶产生菌MSP13筛选及其产酶条件初步优化 (1)
从土壤中筛选产淀粉酶的细菌菌1
从土壤中筛选产淀粉酶的菌株(四川化工职业技术学院食品1131)总述：查资料可知在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加淀粉溶液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
实验流程待测数据：透明圈直径菌落直径摘要：查资料可知枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此从四川化工职业技术学院的土壤中筛选产淀粉酶的细菌菌株，利用五点取样采集土样，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
引言：芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。
早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。
从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。
1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育
功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育22100934 程雅楠摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。
关键词：产淀粉酶细菌筛选选育诱变育种淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。
淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。
此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。
以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
1材料和方法1.1材料1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。
1.1..2培养基：淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
②液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
优化条件培养基配制：①淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 4.0 。
②淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 7.2 。
碳源培养基：①淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。
产淀粉酶菌株的分离和筛选
产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。
【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。
淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。
由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。
本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。
通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。
然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
一株碱性α-淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化
Ｆ ｏ ｎ ｕ ｏ ｄａ ｄＤｒｇ
２ １ 年 第 ｌ 卷第 ０ 期 ００ ２ ５
１７ ６
一
株碱 性 淀粉 酶产生菌 的筛选及产 酶条件优 化 一
宋 燕，李 津
（ 山东博士伦福瑞达制药有 限公司， 山东 济 南 ２ ０ ０ ） ５ １ １
摘 要 ： 目的 获 取 工 业 生 产 上 有 潜 在 应 用 价 值 的 碱 性 淀 粉 酶 产 生 菌 。 方 法 土 壤 中 筛 选 出５ 产 淀 粉 酶 的 菌 株 ； 经 正 交 株 试 验 确 定 培 养 基 的 最 优 组 成 ； 通 过 摇 瓶 发 酵 初 步 确 定 了 发酵 条 件 。 结 果 产 淀 粉 酶 活 性 最 高 的 为 来 源 于 草 地 土 壤 的 菌 株
Ａｆ ｒｃ ｌｖ ｔｄ ｆｒ８ｈｉ ｈ ｋ ｒａ ０ ℃ ｗｉ ０ｒ ｎ ｔｅａ ｌｓ— ｒｄ ｃｎ ｃｉｉ ｆ １一 ｅ ｃ ｅ １ ｔ ｕｔ ａｅ ｓ ａ ｅ ｔ ｅ ｉ ｏ ｎ ４ ｔ １ ／ ， ｈ ｍｙ ａｅｐ ｏ ｕ ｉｇ ａ ｔ ｔ ｏ ￥Ｉ ６ｒａ ｈ ｄ２ Ｕ／ ｈ ８ ｍｉ ｖｙ １４
Ｓ ＯＮＧ Ｙａ ＬＩ ｉ ｎ， ｎ Ｊ
（ｈ ｎ ｏ ｇ ａ ｓｈ Ｌ ｍ ｄ ｈ ｒ ｃｕｉ ｌ ｏ Ｌｄ Ｊｎ ｎ ５ １ １ Ｃ ｉ ） Ｓ ａ ｄ ｎ ｕｃ ＆ ， ， ２ ａ Ａ ｓ ａ ｔ Ｏｂ ｅｔ ｅ ｏｏ ｔｉ ｌａｉｅａ ｌｓ—ｒｄ ｃ ｇｓ ａ ｓ ｉ ａ ｅｐ ｔ ｔ ｌ ａｕ ｓ ｎｔｅｉｄ ｓ ｙ ｂ ｔ ｃ： ｊｃｉ Ｔ ｂａｎａ ｌ ｍｙａｅｐｏ ｕ ｉ ｔ ｉ ｃ ｈ ｖ ｏｅ ｉ ｌｅ ｕｔ ． ｒ ｖ ｋ ｎ ｎ ｒ ｎ ｗｈ ｈ ｎ ａｖ ｉ ｈ ｎ ｒ
／．，它在发酵８ｈ ／６ 时产酶 能力最强 ；优化后 的培养 基为玉米粉３％，蛋 白胨０８％，磷酸氢二钠０６％，硫酸铵０ ． ． ． ２％，氯 化铵０１ ． ５％，ｐ ．。于４ Ｈ ９０ ０℃，１０ｒ ｎ ８ ｍｉ条件 下培养，菌株 ／ ６ ／ ／ ．酶活性 可达 到２１４Ｕ ｍＬ １ ／ 。结论 筛选 出５ 株产淀粉酶 的菌 株 ，其 中菌株 ／ ６ 株耐碱性Ⅱ淀粉酶产 生菌 。 ／一是１ 一 关键词 ：碱性 淀粉 酶；菌株筛选；正交试验 ；优化
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
实验 土壤中产淀粉酶菌株的筛选ppt课件
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背景知识
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实验1 土壤中产淀粉酶菌株的筛选（1）
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实验目的
掌握菌种分离与筛选的方法 从土壤中筛选出能够合成分泌淀粉酶的微生物
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实验原理
自然界微生物种类繁多，有些微生物能够以淀 粉作为碳源进行生长繁殖，这是因为它们能够 合成分泌淀粉酶。
当能合成淀粉酶的微生物在含有淀粉的固体培 养基中生长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围， 使菌落周围的淀粉水解成为小分子量的糊精、 聚糖和单糖。这些水解产物不能与碘作用，从 而在菌体周围形成透明圈。
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分离
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实验步骤
5.各组做好标记，置于30 ℃恒温培养48 h （倒置培养？？）
6. 产淀粉酶菌株的鉴定（下次课）
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6. 产淀粉酶菌株的鉴定
瓶皿上（点植法：用接 种环在固体培养基表面接触几点），同时用签字笔 按对应顺序对各单菌落进行标号。
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实验步骤
1. 筛选培养基的配制（已完成） 可溶性淀粉2 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨
10 g，琼脂20 g，水1000 mL。
2. 倒平板（每组6个，每个平板10mL左右）
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实验步骤
3. 土样的采集
各实验室分别取三种不同环境的土样并记录当 时取样环境情况（1-2、3-4、5-6每两小组在同 一个地方进行取样），通常取离地面5～15cm 处的土壤。
菌落被挑起而不致破碎 菌落颜色多样，菌落正反面颜色常不一致 带有泥腥味
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淀粉酶产生菌的筛选诱变选育及产酶条件优化研究
试管编号 1μg/μL葡萄糖 蒸馏水(μL) 标准液体(μL)
1
100
1900
2
200
1800
3
300
1700
4
400
1600
5
500
1500
6
600
1400
DNS(μL)
2000 2000 2000 2000 2000 2000
平均 OD540
淀粉酶酶活测定步骤
试管A（空白） ↓ 加淀粉液含缓冲液1.5mL ↓ 取2mL DNS ↓ 加入0.5mL 稀释粗酶液 ↓100℃，10min 快速冷却，取2.00ml反应液 ↓ 加入4mL水，于540nm测酶活
? 大实验结束，清点回收仪器，提交实验报告。
谢谢大家！
主要来源于根霉、曲霉、青霉、芽孢等菌属。
淀粉酶的 应用
实验内容
? 建立高产淀粉酶产生菌初筛方法 ? 建立高产淀粉酶产生菌复筛方法 ? 建立淀粉酶酶活测定方法 ? 建立高产淀粉酶菌诱变育种方法 ? 建立高产淀粉酶产生菌产酶条件优化方法
实验目的
? 掌握淀粉酶产生菌 初筛方法 ? 掌握淀粉酶产生菌 复筛方法 ? 掌握淀粉酶酶活测定 方法 ? 掌握紫外诱变育种 方法 ? 掌握微生物 产淀粉酶条件优化 方法
产淀粉酶菌株诱变剂量选择
? 1. 培养基：葡萄糖2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，水 1000ml ? 2. 将出发菌株从试管中用25mL无菌生理盐水多次洗出，倒入含有玻璃珠的无
菌三角瓶中，进行反复振荡20min。 ? 3. 吸出5mL至含有磁针的无菌平皿中，置于磁力搅拌器上，缓慢加速磁力搅拌
实验一 淀粉酶产生菌的筛选
培养基制备 配制肉汤培养基 45ml，分装于 250ml三角瓶中，纱布封口，
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产淀粉酶菌株的初筛 称取窖泥１ ｇ，放入盛有９９ ｍＬ灭菌分离培养基的
三角烧瓶中，静止培养２４ ｈ，吸取富集菌液０．５ ｍＬ，进
行不同浓度梯度稀释，分别取０．１ ｍＬ涂布于分离培养基
口．淀粉酶和葡萄糖淀粉酶将其水解为可发酵的糖类。淀 粉脱支酶同仅．淀粉酶和∥．淀粉酶等水解酶不同，其作用
对象为ａ．１，６．糖苷键，但它不能直接降解淀粉，只有当 ６【．淀粉酶作用后才降解支链淀粉口９１。因此在白酒发酵过 程中，只有在４种酶的共同作用下，才能使谷物中的直链 和支链淀粉更好地被降解，从而提高出酒率。 本实验选取东北寒区优质老窖窖泥，利用五点取样
用于白酒大曲的强化和处理酒糟；谢建华等【１４１从南宁酒 厂附近土壤中筛选到一株产淀粉酶的野生菌株ＧＸＢＡ－４， 经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏ蛔ｕｅｆａｃｉｅｎ）； Ｒｏｈｂａｎ等¨习在伊朗高盐度湖泊中分离出４９个极端嗜盐 微生物，可产淀粉酶和蛋白酶等多种酶，并且鉴定了菌
属；Ｎｏｒａｓｈｉｒｅｎｅ【ｌ卅从马来西亚温泉中筛选出１１株产淀
酶、糖化酶、脱支酶）的细菌，以期筛选生产４种酶活性
测定初筛菌株的淀粉酶活力进行复筛。用发酵培养
基对目的菌株进行培养，分别测定仅．淀粉酶、声．淀粉酶、 糖化酶和脱支酶的活力。 脱支酶活力单位定义为在４５℃、ｐＨ ６．８条件下，
１
均较高的菌株，并对筛选出的菌株进行鉴定。细菌产４种 淀粉酶的调控基因不同口∞８｜３０】，其水解机制也不相同，但
文献标志码：Ａ
文章编号：１００２．６６３０（２０１５）１１－０１７７．０５
白酒是我国传统的发酵食品，因其独特的酿造工艺及 其呈现的特殊风味，在世界酒类产品中别具一格【”。在传
统固态浓香型白酒发酵中，窖泥是白酒风味形成的基础，
用于烧酒制各中淀粉原料的加工［１ ２１。龙茜萍等【ｌ”从贵州 某酒厂大曲中分离得到一株产糖化酶活力较高的菌株，
１
作用，从而提高白酒发酵的原料利用率和出酒率。
１
ｍｉｎ内水解可溶性淀粉产生ｌ Ｉ＿ｔｍｏｌ还原糖所需的酶量。
材料与方法
４种酶活力均采用３，５．二硝基水杨酸（３，５．ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ＤＮＳ）比色法确定‘１７弦翊。
１．１
材料、试剂与培养基 窖泥来自黑龙江省富裕老窖酒业有限公司的优质老
ａ
ｈｉｇｈ－ ａｎｄ
ｑｕａｌｉｔｙ ｌｉｑｕｏｒ ｐｉｔ ｍｕｄ．Ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ
ａ—ａｍｙｌａｓｅ，ｔ－ａｍｙｌａｓｅ，ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ
ａｓ
ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ａｍｙｌｏ幻ｕｅｆａｃｉｅｎｓ
ａｎｄ
ｎａｍｅｄ
ＭＳＰｌ ３．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
ａｎｄ ３７℃．Ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ
ａｍｙｌａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ｔｏ
ｂｅ ０．１５
ｇ甩ＣａＣｌ２，０．３舡ＭｇＳ０４‘７Ｈ２０，ｐＨ ５．５
１．６４５％ｏｎ
ａｖｅｒａｇｅ．
分离筛选得到一株高产糖化酶的黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）。近几年许多学者分别从富含淀粉的土壤样品、 海洋泥中和污水排放口处的土样中，都筛选出产淀粉酶 的菌株，并对其进行了鉴定”昏”Ｊ。
３年起，日本研究者三田利用白曲霉
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎ西ｄｕｓ Ｌｉｎｋ）生产出一种酸性淀粉酶，适
表２
Ｔａｂｌｅ ２
ｒＤＮＡ片段的测序与系统发育分析
菌株ＭＳＰｌ３的形态特征
将ＰＣＲ产物送至生工生物工程（上海）股份有限公 司进行序列测定。再将测序所得到的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列与 ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行ＢＬＡＳＴ比对分析，通过ＭＥＧＡ软件 构建系统发育树。
１．３．６ 名称
ＭＳＰｌ３
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＭＳＰｌ３ 光滑 裙皱 湿度 湿润 边缘 整齐 革兰氏染色 阳性 菌形 杆状 芽孢着生位置 中
１．３．４
菌株形态学及生理生化鉴定 参照《伯杰细菌鉴定手册》ｐ引，对筛选出高淀粉酶
窖池。
ＤＬｌ ５０００ ＤＮＡ
活力的菌株进行形态学描述和生理生化鉴定。生理生化
Ｍａｒｋｅｒ、细菌基因组ＤＮＡ试剂盒
鉴定包括：甲基红实验、乙酰甲基甲醇实验、柠檬酸盐
利用实验、多种糖发酵实验、好氧性实验、明胶液化实 验、脲酶实验、蛋白胨水解实验、硫化氢实验、硝酸盐
ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ ３
Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：ａｍｙｌａｓｅ；ｌｉｑｕｏｒ ｐｉｔ
ｍｕｄ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｌｉｑｕｏｒ
中图分类号：Ｑ８１５
ｄｏｉ：１０．７５０６／ｓｐｋｘｌ００２—６６３０．２０１５ ｌ １０３４
品酶、多糖和抗生素等的主要发酵微生物【ｌ”。在白酒生产 中，淀粉酶起着液化和糖化的作用，是白酒出酒率的重要 保证。因此通过筛选窖泥中高活力淀粉酶菌株，并应用于 白酒发酵，将会明显提高白酒的出酒率。
从ｌ
９ ６
粉酶的嗜热菌，经鉴定这些菌株为分枝杆菌属。张文
丽等【Ｉ刀从吉林某豆制品加工厂污水排放口处的土样中，
鉴定该菌株为黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ），该菌株可应
长期的工艺操作使窖泥富集了种类繁多、功能各异的益于 酿酒的微生物菌群【２｛】。中国浓香型白酒的生产基础是泥 窖窖池，窖泥中的微生物在发酵过程中起着举足轻重的作
用【９ｌ。要产好酒，就必须有优质的窖池，而优质的窖池其 本质在于窖泥，优质的窖泥能产生香气，可大幅度提高白 酒的档次（１ ｏ】。窖泥中多种霉菌、酵母菌和 蛋白胨１０
ｐＨ
哈尔滨宝信生物科技有限公司。
ｇ、 ０００ ｍＬ，
分离和保藏培养基：可溶性淀粉２ ｇ、牛肉膏３
ｇ、ＮａＣｌ ５
还原实验和过氧化氢实验等，每个实验重复３次ｍ’３ ９１。
１．３．５ １．３．５．１ １ ６Ｓ
ｇ、琼Ｊ］旨２０ ｇ、蒸馏水１ ７．０～７．２，固体加入１５～２０ ｇ琼脂，１２１℃灭菌２０ ｍｉｎ。 ｇ、ＭｇＳ０４・７Ｈ２０
※生物工程
艮晶科学
２０１５，Ｖ０１．３６，Ｎｏ．１１
１７７
淀懈生菌懈Ｐ１３筛选及其产酶条件初步优化
马晓梅，赵辉木
（黑龙江大学生命科学学院，农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨
１５００８０）
摘要：从优质白酒窖泥中分离筛选出１３株产淀粉酶的兼性厌氧细菌，通过测定口．淀粉酶、口．淀粉酶、糖化酶和 脱支酶酶活力，最终筛选出一株生产４种淀粉酶活力均相对较高的菌株，并对其进行形态观察，生理生化指标和
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅ—Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓ位ａｉｎ
５．５和温度３７℃。优化后的菌
ＭＳＰｌ３
ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ＭＡ Ｘｉａｏｍｅｉ，ＺＨＡＯ Ｈｕｉ丰 （Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ
４种酶在最适温度、最适ｐＨ值及对金属离子的需求上有 很大相似之处ｐ“３４］，因此优化最适的酶活性条件，以期提 高４种淀粉酶的活力，使４种酶在一个最适的条件下协同
ｍｉｎ内水解支链淀粉产生１／ａｍｏｌ还原糖所需的酶量；
ａ．淀酚酶与声．淀粉酶活力单位定义为在４０℃、ｐＨ ５．６条
件下，１ ｍｉｎ陕］水解可溶性淀粉产生ｌ“ｍｏｌ还原糖所需的 酶量；糖化酶活力单位定义为在３０℃、ｐＨ ４．６条件下，
１６Ｓ
ｒＤＮＡ鉴定，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并将其命名为ＭＳＰｌ３。对菌株ＭＳＰｌ３产酶条件进行初步优化，确
ｇ／Ｌ，ｐＨ
定其产酶的较佳条件是：ＣａＣｌ２质量浓度０．１５ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ．・７Ｈ２０质量浓度０．３ 株ＭＳＰｌ３生产４种酶的酶活力平均提高了３１．６４５％。 关键词：淀粉酶：窖泥；鉴定：筛选：白酒
５＇－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ一３’；反向引物１５１２Ｒ：
菌２０ｍｉｎ。
１．２
仪器与设备 聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ
ＰＣＲ扩增反应体系和程序
ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）仪 上海精密科
德国Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司；ＤＧＧＥ电泳仪 学仪器有限公司。
１．３ １．３．１
美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司；
０．５
ｍｉｎ，５６℃退火１ ｍｉｎ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，３２个循环，
依据生态学原理，采用五点法对酒厂的优质窖池中
７２℃终延ｆ，８ ｍｉｎ，４℃保存。
万方数据
※生物工程
１．３．５．３
良晶科学
２．２ ２．２．１
２０１５，ＶｏＬ３６，Ｎｏ．１ｌ
１７９
目的片段与载体连接
菌株的鉴定 筛选菌株的形态学观察及生理生化鉴定 对菌株ＭＳＰｌ３进行形态学观察和生理生化鉴定，结
１．３．２
粉链的吐．１，４糖苷键，产物为小分子糖和短链糊精的
混合物［２ ６１。口．淀粉酶是外切型水解酶，能从淀粉链的非 还原性末端顺次切下一分子麦芽糖口”。葡萄糖淀粉酶也 是一种外切型水解酶，它从淀粉链的非还原末端顺序切 开ａ．１，４．糖苷键生成一分子葡萄糖旺”。因此ａ．淀粉酶为 伊淀粉酶和葡萄糖淀粉酶提供充足的淀粉链非还原末端，