实验一淀粉酶产生菌的分离和酶活性测定-附件
《发酵工程实验》
《发酵⼯程实验》实验⼀淀粉酶⽣产菌的筛选⼀、实验⽬的学习淀粉酶产⽣菌的筛选⽅法。
⼆、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、⾷品加⼯、医药等领域有⼴泛⽤途。
淀粉酶是⼀类淀粉⽔解酶的统称，它能将淀粉⽔解成糊精等⼩分⼦物质并进⼀步⽔解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被⽔解后，遇碘不再变蓝⾊，因此可根据淀粉培养基上透明圈的⼤⼩来判断所选菌株的淀粉酶活⼒。
三、实验⽤品1．样品淀粉含量丰富的⼟样。
2．培养基⾁汤培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，加⽔⾄1000ml，pH7.0。
121℃灭菌20min。
初筛平板培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加⽔⾄1000ml，pH7.4。
121℃灭菌20min。
Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏⽔300ml。
先将碘化钾溶解在少量⽔中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加⾜⽔即可。
3．器材⾼压蒸汽灭菌锅，超净⼯作台，电⼦天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三⾓瓶，培养⽫，移液管，洗⽿球，试管，试管架，接种针，涂布棒。
四、实验⽅法1．培养基制备：配制⾁汤培养基45ml，分装于250ml三⾓瓶中，纱布封⼝，灭菌。
配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三⾓瓶中，封⼝膜封⼝，灭菌。
2．倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却⾄50～60℃，以⽆菌操作法倒⾄已灭菌的培养⽫中，⾄盖满底部。
冷却凝固待⽤。
3．样品预处理：取5g⼟样接⼊45ml⾁汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成⼟壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4⽀试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每⽀试管内加⼊9mL⽆菌⽔。
⽤⽆菌移液管从三⾓瓶中吸取1mL⼟壤悬液，加⼊到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加⼊到10-3试管中，依此类推直⾄10-5试管。
4．平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。
实验一 α-淀粉酶活力的测定
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果 单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果 直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5
60 —酶活定义中反应时间为60min； T —反应时间（min）； 20 —可溶性淀粉的毫升数； 2% —可溶性淀粉浓度； N —酶液稀释倍数； 0.5 —测定时所用的稀酶液量（ml）。
表 1 α-淀粉酶活力测定结果
X
[实验结果处理要求]
酶活力单位gml60t202n05实验结果计算实验结果计算重复数反应时间min酶活力gmlmin要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[实验性质] 验证性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；
[实验步骤]
第一步：待测酶液的配制； 第二步：标准色的配制； 第三步：样品的酶解反应； 第四步：计算。
1. 待测酶液的制备
α-淀粉酶
1.000 g
①
50 mL
2. 标准色的配制
150mL
60℃,30 min
250 mL
③可溶性淀粉 2.0g
酶液
2%淀粉液
A液
②
B液
8.0 mL 1.0 mL
3. 样品测定步骤
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材 料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一 下午3点。先交到课代表，由课代表汇 总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。
产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法注明：蓝色字体是已修改的一、实验目的1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；2、掌握测定酶活力的方法；3、培养自行设计、实施实验的能力。
二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。
待实验前取样即可。
2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。
在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。
4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
三、实验材料1、土壤样品湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。
2、培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液4、玻璃器皿锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种环等四、实验步骤1、样本采集①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。
淀粉酶产生菌的筛选
实验一淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定指导老师：辛树权生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆同组人：xx xxx摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。
我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。
利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。
再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。
关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计一、实验目的：1、学习从土壤中分离微生物的方法；2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。
二、实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。
在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。
淀粉遇碘呈蓝色。
这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。
随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
三、实验器材及试剂：1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园2培养基：（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。
实验一 淀粉酶产生菌的分离和酶活性测定 - 附件
本科学生实验报告学号： 124120463 姓名：学院：生命科学学院专业、班级： 12级生物技术班实验课程名称：酶工程实验一教师：吴倩云南师范大学教务处编印实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定一、目的要求1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。
2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。
二、基本原理（一）淀粉酶产生菌的分离1.菌种的采集①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。
②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。
2.富集培养①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。
②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。
3.菌种的分离①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。
②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
2.酶活定义：在一定pH5.5、37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W）A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmolW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）3绘制标准曲线①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
酶的活性测定实验报告
一、实验目的1. 了解酶活性测定的原理和方法。
2. 掌握酶活性测定的操作步骤。
3. 学会分析实验结果，了解酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的进行。
酶活性是指酶催化特定反应的能力，通常以单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示。
本实验采用比色法测定酶活性，通过测定酶催化反应产物的生成量来间接反映酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 仪器：紫外分光光度计、恒温水浴、电子天平、移液器、试管等。
2. 试剂：淀粉酶、淀粉溶液、碘液、NaOH溶液、HCl溶液等。
3. 材料：新鲜土豆、苹果、黄瓜等。
四、实验步骤1. 淀粉酶的提取- 称取新鲜土豆或苹果，切碎后加入适量的蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆过滤，取滤液备用。
2. 淀粉溶液的制备- 称取一定量的可溶性淀粉，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
- 将淀粉溶液煮沸，使其糊化，冷却后备用。
3. 酶活性测定- 取适量淀粉溶液，加入一定量的酶液，混合均匀。
- 将混合液放入恒温水浴中，保持一定温度。
- 定时取样，用碘液滴定，计算淀粉的剩余量。
- 根据淀粉的剩余量，计算酶活性。
4. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 将淀粉溶液和酶液在不同温度、pH值下进行混合，观察酶活性变化。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定结果- 根据实验结果，计算酶活性单位。
2. 不同温度、pH值对酶活性的影响- 在不同温度、pH值下，酶活性变化如下：- 温度：在适宜的温度范围内，酶活性随着温度的升高而增加，超过适宜温度后，酶活性逐渐降低。
- pH值：在适宜的pH值范围内，酶活性随着pH值的升高而增加，超过适宜pH值后，酶活性逐渐降低。
六、实验结论1. 酶活性是指酶催化特定反应的能力，可以通过比色法等方法进行测定。
2. 酶活性受温度、pH值等因素的影响，适宜的温度和pH值可以提高酶活性。
3. 本实验成功测定了淀粉酶的活性，并探讨了温度、pH值等因素对酶活性的影响。
实验一 淀粉酶产生菌的筛选
实验一淀粉酶产生菌的筛选一、实验要求：1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤；2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量；3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株；4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养条件和培养时间。
二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌三、实验材料：1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等,2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ;3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。
四、实验步骤：1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。
2、培养基的配置，(1)分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉pH调至7.2121℃灭菌15min待冷却至50℃左右时于超净工作台倒平板。
注:先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状再加到溶化好的培养基中调匀; (2)分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。
3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀,再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中,依此类推直至10-7试管。
α-淀粉酶产生菌株(细菌)的分离纯化及检测
1、菌落周围有透明圈 2、菌落粗糙、颗粒感强、 边缘不整齐、有丝状感 （正反面）
32℃培养 24hr
仔细观察 生长菌落
有无透明 圈（有）
选择12个单 菌落，编号
点接于平板 相应区域
加入检测 碘液显色
测量透明圈 和菌落直径
计算D/d比 值（排序）
选择最好 3-4株菌种
划线接种 斜面
培养好后冰 箱保存备用
本次实验基本流程
准备工作 灭菌 制备分离 用平板 冷却99mL 无菌水 加入分离 样品振荡
十倍梯度 稀释涂布 平板分离
培养
菌落计数 挑菌点接 平板培养 测量透明 圈及菌落 直径 需要留下 培养 留于以后 的，挑于 实验用 斜面保存
平板点接检测流程 （尽量不要打开平板，无菌操作）
平板底部 “十字”划 分 四区域对 应编号
第二种 分离和检测用平板培养基 ——300mL/组
可溶性淀粉 30g； Na2HPO4 .12H2O 8g； （NH4）2SO4 4g； NH4Cl 1.5g； 3%豆粕粉浸出液 1000mL 琼脂 20g 121.3℃灭菌20分钟 注：如果还想使用自已组的设计培养基或其它培 养基也可以。 每组200mL培养基制备10个平板。
记录结果 填表计算
1、测量透明圈直径 2、测量菌落直径 3、计算透明圈与菌落直径比值（D/d） 4、根据D/d值大小排序（挑取4株于 斜面培养后备用）
平板菌落计数
总菌落数 计数 有透明圈 菌落计数
记录结果 填表计算
平板放入 冰箱保存
根据碘液 检测结果
挑取单菌 菌于斜面
清洗干净 平板（字）
1、细菌总数 2、产淀粉酶的菌数 3、产淀粉酶菌株占总菌数的比例
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YUNNAN NORMAL U NIVERSITY
本科学生实验报告
学号：124120463 姓名：________________________
学院：生命科学学院专业、班级：12 级生物技术班
实验课程名称：_________ 酶工程实验一_______________________ 师：________ 吴倩_______________________________
云南师范大学教务处编印
实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定
一、目的要求
1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。
2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。
二、基本原理
（一）淀粉酶产生菌的分离
1. 菌种的采集
①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。
②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有
某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。
2. 富集培养
①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大
量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。
②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。
3. 菌种的分离
①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。
②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可
使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1. 原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热
后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm 进行测定。
2. 酶活定义：在一定pH5.5、37C条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放
1卩mol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式：酶活（U/g）=A X 5X K X N X 1000/（T X W）
A:样品的OD值（平均值）K:标准曲线的斜率
N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000 ^mol
W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）
3 绘制标准曲线
①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分
别测定它们的吸光度A。
②以A 为横坐标，浓度c 为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲
线。
③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找
出对应的被测溶液浓度或含量
三、器材
1试剂：
可溶性淀粉、碘、碘化钾、 HCI 、柠檬酸、Na2HPO4 12H2O 等
o 严并甘・
2培养基：
分离、纯化培 养基
3仪器：
① 平皿、 三角瓶、大试管、1mL 和10mL 移液枪、涂棒；
② 天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温 水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。
四、操作步骤
（一）淀粉酶产生菌的分离
1. 培养基 的配制及灭菌
倒平板配制分离培养基
'高压灭菌30min 冷却至约50C
倒7块平板/140mL 1
=冷却备用
2. 制备土壤稀释液
① 称取土样1g ,放入9mL 无菌水试管中，摇动10min ,静置10min,制备得 到10-
1 土壤稀释液； ② 用无菌吸管吸出1mL 土壤悬液，加入盛有9mL 无菌水的大试管中，充分 混匀，制备得到10-
2 土壤稀释液； ③ 再从中吸出1mL 加入盛有9mL 无菌水的大试管中，混匀后得到10-
3 土壤 稀释
液；
④ 以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀释液。
3. 涂布
用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6 和10-7 土壤稀释液各
0.1mL ，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。
4. 培养纯化
②配置发酵培养基200mL/S （ 40mL/瓶' 最大的亍' 菌落接种于发酵培养基中
72h 。
2.葡萄糖标准曲线的制作
①精确称取0.100g 葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml ，制得浓度为1mg/ml 的葡萄糖的
标准溶液。
标准曲线如下图表所示：
挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板， 杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养）。
5.产淀粉酶微生物的鉴定
向平板内加入稀碘液数滴后进行观察
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1.淀粉酶产生菌的发酵
①分离培
可溶性淀粉：0.7g
KH2PO4 : 0.07g
琼脂 ：2.8g 37C 倒置培养2〜3d （如发现
的配制： 蛋白胨：0.7g
MgSO4?7H2 :0.02g
酵母膏：0.7g
CaCl2?2H2O : 0.08g
将纯培养得到的（透明圈 30 C 1
「50r/min 摇瓶发酵约
②待测酶液的制备:
a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件4000转/5分钟，将离心后的上清液倾入
试管中，稀释一定倍数测定其酶活力
b.底物溶液一2%®粉溶液（需当天配置）
称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；
冷却，并用缓冲液定容至100mL
注：如果测定所得OD fi不在有效值（0.2-0.8 ）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。
五、酶活测定注意事项注：
1. 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
2. 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS寸，枪头不要触碰管壁，也不要伸
入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！
3. 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
4. 避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5. 实验结果的记录与分析
六、实验报告
（二）葡萄糖标准曲线绘制 ①葡萄糖标准曲线的制作 葡萄糖标准曲线
OD
+ 系列1 -- 线性（系列
严*—量含糖萄葡
0D的平均值=(A+B /2=(0.332+0.289)/2=0.3105
根据酶活计算公式：
酶活(u/g) = ((A X K+b) X N X 1000/(T X W))x 5
A:样品的OD值(平均值)K:标准曲线的斜率
N :稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1 毫升体积
T:反应时间(min) 1000:转换因子1mmol=1000 gol
W:葡萄糖的分子量(180.2g/mol)
代入数据可得：
酶活( u/g)=( (A X K+b)X N X1000/(T X W))X 5 =((0.3105X0.9479+0.126)X 1X1000/(15X180.2)) X5 = 0.7775
3、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。
答：采集土样(除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm~10cmt壤)
将采集的土样进行10 -1 ~10 -6 梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培养基上，在30E的恒温箱中培养3d,然后观察菌落周围是否形成透明水解圈。
因为培养集中含有水溶性较差的植酸钙，因而含植酸钙的平板上会呈现浑浊态。
若菌株代谢产生植酸酶，植酸钙被酶降解，在菌落周围形成透明水解圈，可起到一定指示作用。
此外可选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等4 种常用染色剂添加至平板初筛培养基中，在加深培养基背景色的同时，以增强植酸钙水解后形成的透明圈可见性。