细菌纤维素酶研究进展_陈春岚

高亲和性结合位点［６］。然而， 有的 ＣＢＤ 的作用似乎不在于跟底 物结合， 而是破坏晶体纤维素链间的非共价相互作用； 或者不 仅结合底物， 还提供结合不同底物结构的优先权。杨永彬［７］等通 过 实 验 证 实 家 族Ⅱ的 ＣＢＤ 能 够 促 使 纤 维 素 中 氢 键 的 断 裂，从 而释放单根纤维素分子链。Ｃ．ｆｉｍｉ 的 ＣｅｎＡ 或 Ｃｅｘ 单独的 ＣＢＤ 不具备对纤维素的水解活力， 但能破坏棉纤维， 形成短纤维， 具 有疏解结晶纤维素的能力。实验证明， 细菌纤维素酶中的 ＣＢＤ 对酶的催化活力是非必需的， 但它们具有调节酶对可溶性和非 可溶性底物专一性活力的作用。 ６．３ 连接桥（ １ ｉｎ ｋｅ ｒ）
【作者简介】陈春岚（ １９７１－ ） ， 女， 广西昭平人， 广西贺州学院讲师， 广西大学硕士研究生， 主要从事微生物学细菌端水解切下纤维二糖单 位， ＢＧ 则将纤维二糖水解成葡 萄 糖 ， 但 对 于 Ｃｅｎ 和 Ｃｅｘ 的 作 用顺序尚未定论。
在已知结构的细菌纤维素酶分子中， 通过在异头碳原子位 通过构型的保留或构型的转化完成催化反应， 其中两个保守的 羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂， 如 Ｃ ． ｔｈｅｒｎｍｏｃｅｌ－ ｌｕｍ 的 内 切 酶 ＣｅｌＣ 催 化 域 中 Ｇｌｕ－ ２８０ 和 Ｇｌｕ－ １４０ 分 别 作 亲 核 试 剂 和 质 子 供 体 ， Ｃ ．ｆｉｍｉ 的 外 切 酶 Ｃｅｘ 的 Ｇｌｕ－ ５７４ 和 Ｇｌｕ－ ６４５ 分别作亲核试剂和质子供体， 证明了细菌纤维素酶降 解 纤 维 素 的 水 解 双 置 换 机 制 。由 于 纤 维 素 底 物 的 高 度 复 杂 性 以 及底物的多样性， 纤维素水解过程的并没有完全清楚。因此， 纤 维素酶系的降解机理还有待进一步研究和探讨。
３ 细菌纤维素酶基因的克隆与表达
细菌中编码纤维素酶的基因在基因组的分布为随机的或 形成基因簇。在基因簇中， 有转录终止子， 没发现有启动子。人 们已从 ４０ 多种细菌中克隆到了纤维素酶基因， 其中一些酶基 因 已 经 在 大 肠 杆 菌 和 酵 母 中 得 到 表 达 。 如 从 Ｓｔｒｏｐｙｏｍｙｃｅｓ、 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒ ｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｍｏｍｏｎｓｐｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ、Ｆｉ－ ｂｒｏｂａｃｔｅｒ 和 Ｂａｃｉｌｌｕｓ 中成功分离出葡 聚 糖 基 因 ， 并 先 后 克 隆 了 瘤 胃 的 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ｓｕｃｃｉ ｎｏｇｅｎｅｓ 、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ Ｒｕ－ ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ 等细菌的纤维素酶基因， 同时热梭菌中的 １１ 种 内 切 纤 维 素 酶（ ＣｅｌＡ、ＣｅｌＢ、ＣｅｌＤ、ＣｅｌＥ、ＣｅｌＦ、ＣｅｌＧ、ＣｅｌＨ、
１ 引言
目前， 纤维素是最丰富的可再生有机资源， 其生物降解主 要 由 微 生 物 — — — 细 菌 和 真 菌 完 成 。细 菌 主 要 产 中 性 纤 维 素 酶 和 碱性纤维素酶， 这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱， 长 期 以 来 没 有 得 到 足 够 的 重 视 。但 原 核 生 物 的 基 因 一 般 不 含 内 含 子， 可直接从基因组 ＤＮＡ 中克隆到目的基因用于工程菌的构 建。因此细菌纤维素酶基因的克隆， 既利于研究纤维素酶基因 的多样性， 也利于高效纤维素酶基因工程菌的构建。随着中性 纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工 业中的成功应用， 以及耐热性纤维素酶在燃料酒精生产中应 用， 细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济 价值。
５ 细菌纤维素酶水解机制
好氧细菌的三种纤维素酶是以各自独立的形式分泌到细 胞外水解纤维素的； 厌氧细菌的三种纤维素酶以多酶复合体形 式 结 合 在 细 胞 壁 上 对 纤 维 素 进 行 水 解 。细 菌 纤 维 素 酶 通 过 多 酶 复合体系各组分协同作用彻底有效降解天然纤维素。Ｃｅｎ 负责 进攻纤维素的非结晶区， 随机水解 β－ １， ４ － 糖苷键， 将长键纤 维素分子截短， 产生大量带非还原性末端的小分子纤维素， Ｃｅｘ
纤维素酶分子的催化结构域主要体现酶的催化活性及对 特定水溶性底物的特异性。不同来源纤维素酶分子量差别很 大， 但其催化区的大小却基本一致， 活性位点的三级结构都是 保守区域。Ｊｕｙ Ｍ ｅｔ 等采用 ｘ 光 衍 射 的 方 法 对 热 纤 梭 菌 的 Ｃｅｌ Ｄ 的催化域进行了结晶和解析［４］。结果表明， 内切酶的活性位点 位于一个开放的“裂缝”（ Ｃｌｅｆｔ） 中， 可与纤维素链的任何部位结 合并切断纤维素链； 外切酶的活性位点位于一个长“环”（ １ｏｏｐ） 所形成的“内部通 道 ”（ ｔｕｎｎｅｌ） 里 ， 它 只 能 从 纤 维 素 链 的 非 还 原 性末端切下纤维二糖。细菌的外切酶有两个酶切位点， 有限酶 切时， 可将 ＣＢＤ 和连接桥分别 切 去 。Ｍｅｉｎｋｅ Ａ 等 利 用 蛋 白 质 工 程 的 方 法 将 粪 碱 纤 维 单 胞 菌 的 外 切 酶 Ｃｂｈ Ａ 分 子 的 Ｌｏｏｐ 删除后， 发现该酶的内切酶活性提高［５］。根据其氨基酸序列的相 似性已知的纤维素酶的 ＣＤ 可分为 ７０ 多个家族， 在同 一 家 族 内具有相似的分子折叠模式和保守的活性位点， 因此在同一家 族内， 其反应机制和对底物的特异性都可能相同， 这已通过实 验得到证实。 ６．２ 纤维素结合结构域（ ＣＢＤ）
许 多 纤 维 素 酶 主 要 依 靠 在 肽 链 Ｎ 端 或 Ｃ 端 的 ＣＢＤ 结 合 底物， 该结构又称纤维素结合模块， 其功能是将相邻的催化结 构 域 传 递 到 晶 体 纤 维 素 底 物 上 。 细 菌 纤 维 素 酶 的 ＣＢＤ 由 １００－ １１０ 个氨基酸组成， 同源性较低。细菌 ＣＢＤ 平坦的表面只 露出 ２ 个或 ３ 个芳香族氨基酸残基和一些形成氢键的残基，多 项研究证实， 这些残基与 ＣＢＤ 对结晶纤维素的结合有关。一些 细菌的 ＣＢＤ 结构有一定的共同特点： 带电荷氨基酸含量很低； 羟基氨基酸含量很高； 都含有 Ｔｒｐ、Ａｓｎ 和 Ｇｌｙ， 而且两个 Ｃｙｓ 在 Ｎ、Ｃ 末端 的 位 置 完 全 相 同 。 汪 天 虹 等 用 多 维 核 磁 共 振 和 Ｘ 射 线 衍 射 技 术 ， 证 实 了 族 Ⅱ Ｃ． Ｆｉｍｉ Ｃｅｘ、Ｃｅｎ 以 及 族 Ⅲ Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｈｕｎ Ｃｉｐ 的 ＣＢＤ 有相似的结 构 ： 由 ２ 个 β 片 层 面 对 面折 叠 在 一 起 ， 形 成 一 个 β 三 明 治 结 构 ， ＣＢＤｃｅｘ 含 有 一 个 单 一 的 二 硫 桥 连 接 Ｎ－ 末 端 和 Ｃ－ 末 端 ， ＣＢＤｃｉｐ 有 一 个 Ｃａ２＋ 的
４ 细菌纤维素酶分类
细菌纤维素酶是多酶复合体系， 根据各酶的功能可分为三 大 类 ：（ １） 内 切 葡 聚 糖 酶 （ １，４－ Ｄ－ ｇｌｕｅａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ 或 ｅｎ－ ｄｏ－ １，４－ β－ Ｄ－ ｇｌｕｃａｎａｓｅ， ＥＣ ３．２．１．４） ， 简称 Ｃｅｎ。作 用 于 纤 维 素 内 部 的 非 结 晶 区 ， 随 机 水 解 β－ １，４－ 糖 苷 键 ， 将 长 链 纤 维 素 分子截短， 产生大量非还原性末端的小分子纤维素， 其分子量 大 小 约 为 ２３－ １４６ＫＤ。（ ２） 外 切 葡 聚 糖 纤 维 二 糖 水 解 酶 （１，４－ β－ Ｄ－ ｇｌｕｃａｎ ｃｅｌｌｏｂｉｏ－ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ 或 ｅｘｏ－ １，４－ β－ Ｄ－ ｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＣ３． ２．１．９１）， 简称 Ｃｅｘ。作用于纤维素线 状 分 子 末 端 ， 水 解 β－ １， ４－ Ｄ－ １４ 糖 苷 键 ， 依 次 切 下 一 个 纤 维 二 糖 分 子 ， 故 又 称 为 纤 维 二 糖 水 解 酶 （ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）， 分 子 量 约 ３８－ １１８ ＫＤ。（ ３） β－ 葡 萄 糖 苷 酶（ β－ １，４－ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ＥＣ３．２．１．２１） 简称 ＢＧ 或称纤维二糖酶。这类酶一般将纤维二糖 或可溶性的纤维糊精水解成葡萄糖分子， 其分子量约为 ７６ＫＤ。
【摘 要】 概述了细菌纤维素酶的水解机制及其基因的克隆和表达， 总结了近年来纤维素酶结构和功能方面的研究成果，
展望细菌纤维素酶领域的研究前景。
【关键词】 细菌； 纤维素酶； 基因克隆； 结构与功能
【中图分类号】 Ｑ５５６ 【文献标识码】 Ａ
【文章编号】 １００３－ ２６７３（２００７）０１－ ００１８－ ０３
ＣｅｌＩ、ＣｅｌＪ、ＣｅｌＫ、ＣｅｌＳ） 的 基 因 已 经 被 克 隆 ， 嗜 纤 维 梭 菌 的 ５ 种 内切纤维素酶（ ＥｎｇＡ、ＥｎｇＢ、ＥｎｇＣ、ＥｎｇＤ、ＥｎｇＥ） 已经测序并在 大 肠 杆 菌 中 得 到 表 达 。杨 智 源 、刘 永 生 、游 银 伟 等 从 不 同 的 细 菌 中克隆了内切葡聚糖酶基因［１，３］。Ｋｉｍ 等 克 隆 了 Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉ－ ｃｕｓ ＶＦ５ 编码 ＥＧ 的 ｃｅ１８Ｙ 基因， 在 Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ － Ｂｌｕｅ 中成功 表 达 ， Ｈａｋａｍａｄａ 等 运 用 盒 式 连 接 介 导 ＰＣＲ 和 反 向 ＰＣＲ 克 隆 到了基因 ｅｇｌ－ ２５７。 人 们 将 纤 维 素 酶 、纤 维 二 糖 等 外 源 基 因 转 入运动发酵单胞菌（ Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ） 中并得 到 不 同 程 度 的 表达， 有望将它改造为能将纤维素转化为乙醇的重组菌株并在 工业中广泛应用。细菌葡聚糖酶基因在 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 的启动子 和信号肽的控制下构建在同一质粒载体上， 然 后 转 入 Ｓ．ｃｅｒｅ－ ｖｉｓｉａｅ， 重组菌可向培养基分泌保留 ７０％活 性 的 葡 聚 糖 内 切 酶 和外切酶， 这种酶能够分解滤纸和木浆中的纤维素。
２００７ 年 １ 月 第１期
广西轻工业 ＧＵＡＮＧＸＩ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＬＩＧＨＴ ＩＮＤＵＳＴＲＹ
细菌纤维素酶研究进展