多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书
实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。
2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。
二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。
酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。
其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。
多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。
多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。
因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶?邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2?O2——————→邻醌＋H2O?三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。
2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。
多酚氧化酶的活性测定的报告
朴东日：多酚氧化酶活性的测定。
一、试验目的本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原理及操作技术。
二、试验原理酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。
本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
三、试验材料、试剂及试验用品材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯处理。
药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）四、实验方法：1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。
2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。
将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。
以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。
3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。
(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。
4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。
多酚氧化酶活性的测定
三、实验材料、仪器与试剂 1.材料：马铃薯； 2.仪器：恒温水浴、分光光度计、试管等； 3.试剂： 0.5%邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬 酸缓冲液（PH6.0）。
四、实验方法： 1.设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测定。 2.酶液的制备：称取样品5.0g， 用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容至 100ml，在18-20℃下浸提30分钟，中间摇动数次，过滤备用。 3.测定： （1）对照：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预 热后加入1mL灭酶后的酶液，2mL蒸馏水，以此调零。 （2）样品测定：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬 酸缓冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴 中预热后加入1mL酶液， 2mL蒸馏水，反应5分钟，加热灭酶 以终止反应，以5000r/min离心10分钟，取上清液备用。在 410nm下测定吸光度。
五、实验结果记录及分析： 以每分钟A410变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位 （u）
A V 410 T 多酚氧化酶活性 [ u /g （ m ） in ] W V 0 . 01 t S
式中：A410：反应时间内吸光度的变化， W：样品鲜重g， t：反应时间min，本次实验为5min， VT：提取酶液总体积ml， Vs：测定时取用酶液体积ml。
实验五 多酚氧化酶活性的测定
Hale Waihona Puke 一、实验目的：通过实验掌握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解 诸如：果实受伤、组织变褐的原因等。
二、原理与方法 多酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验 是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌， 在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD 值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
一种多酚氧化酶(PPO)抑制剂及其制备方法和应用[发明专利]
![一种多酚氧化酶(PPO)抑制剂及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/4a6004036294dd88d1d26b9e.png)
专利名称：一种多酚氧化酶（PPO）抑制剂及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：张青叶,齐晓娟,刘梦苑
申请号：CN201810606714.5
申请日：20180613
公开号：CN108623505A
公开日：
20181009
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种多酚氧化酶(PPO)抑制剂，所述抑制剂为N‑取代苯基‑取代酰肼氨基硫脲类化合物；该多酚氧化酶(PPO)抑制剂的制备方法为：在100mL的单口圆底烧瓶中依次加入1mmol 取代异硫酸氰酯和1mmol取代酰肼，再加入15mL无水乙醇溶解，室温下反应约2‑6h，反应结束后，进行抽滤，得到的固体用无水乙醇重结晶，30℃真空干燥得到目标化合物。
本发明制备的化合物对多酚氧化酶(PPO)具有较高抑制活性，可以作为抗氧化剂的有效成份，应用前景广阔。
申请人：华中农业大学
地址：430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：王敏锋
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PPO测定
实验11、多酚氧化酶（PPO）活性的测定《果蔬采后生理生化实验指导》曹建康姜微波赵玉梅编著一、原理多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。
在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm 处有最大光吸收峰。
因此可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。
二、仪器设备1、研钵2、高速冷冻离心机3、分光光度计4、计时器5、移液器6、离心管7、试管8、容量瓶（100 mL 、1000 mL）三、试剂1、0.1 mol·L—1 、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液母液A（200 mmol·L—1 醋酸溶液）：量取11.55 mL 冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000 mL 。
母液B（200 mmol·L—1 醋酸钠溶液）：称取16.4 g 无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000 mL 。
取68 mL 母液A和432 mL 母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000 mL 。
2、提取缓冲液（含1 mmol PEG、4% PVPP、和1% Triton X—100）称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮），取1 mL Triton X—100，用0.1 mol·L—1 、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100 mL 。
3、50 mmol·L—1 邻苯二酚溶液称取275 mg 邻苯二酚，用0.1 mol·L—1、pH 5.5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50 mL 。
四、实验步骤1、酶液制备：称取5.0 g 样品，置于研钵中，加入6.0 mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，再用10 mL 分次清洗研钵，用抽滤法进行粗滤，使用液相纯化膜进行精滤，即得到酶提取液，低温保存备用。
多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书
多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书微量法货号：BC0195规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系本公司工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体100mL×1瓶4℃保存粉剂粉剂×1瓶4℃保存试剂一液体20mL×1瓶4℃保存试剂二液体5mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。
产品说明：PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
PPO能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管对照管试剂一200200试剂二5050样本50煮沸的样本5037℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。
充分混匀，5000g，常温离心10min，收集上清，取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。
多酚氧化酶(PPO)的分离提取
多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、原理与目的多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。
多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。
PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。
多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组100-200g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M 巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置时配（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机三、操作步骤1：粗酶提取：水果肉组织按1：1（W/V）比例与003M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm 离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
PPO酶测定
红三叶品种：岷山、春茵、瑞德、巫溪、炫丽、巫溪、磷酸缓冲液 0.05mol/L 磷酸氢二钠 3.28g 磷酸二氢钠0.27g 1000ml容量瓶 PH=7.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液0.1mol/L 磷酸氢二钠 0.87g、柠檬酸二甲0.23g邻苯二酚0.2mol/L----0.3 mol/L 2.20g于100ml容量瓶ＰＰＯ酶测定PPO常用的测定方法有比色法[1]和氧电极法PPO活性测定方法较多,有减压法、耗氧电极法、分光光度法、精密计时测定法、高效液相色谱法等。
Lamk in和M cCaig提出以邻苯二酚为底物测定小麦PPO活性较为敏感、稳定,而且操作简便,费用低,适用于大规模检测PPO活性测定参照Coseteng速率法[6]并加以改进：取0.10mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.2)2.6mL,分别与0.20mol/L邻苯二酚（底物）0.3mL混合,28℃水浴中预热5min,加入0.1mLPPO提取液, 立即用生化自动分析仪在420nm处测定OD值。
每隔10s读取一次OD值。
以每mL酶液在1min内引起吸光值增加0.001所需的量为一个酶活性单位(以unit/min表示)。
以上测定均重复3次。
一、原理与方法PPO催化各种酚与O2氧化为醌。
本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。
在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。
二、仪器与试剂（1）样品：多酚氧化酶粗酶液硫酸铵沉淀组分DE-52洗脱组分葡聚糖凝胶洗脱组分（2）底物：邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液（3）反应体系：0.2M邻酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8（4）器皿与仪器：试管、恒温水浴等分光光度计三、酶蛋白的比活性比活性＝酶活单位（U）/mg蛋白质四、实验结果与分析1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）结果列表试管号蛋白质浓度PPO酶活试管号蛋白质浓度PPO酶活空白0 0 3 0.16 0.09粗酶液0.20 0.14 4 0.03 0.031 0.00 0.01 5 0.03 0.012 0.13 0.09 6 0.02 0.02分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。
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多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
测定原理：
PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体，60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体，40mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体，10mL×1瓶，4℃避光保存；
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）或果汁样本的处理：
按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。
5min
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充分混匀，10000g，25℃离心10min，取上清，525nm处检测测定管和对照管吸光度。
ΔA=A 测定管-A对照管。
注意：煮沸样本的操作：取300μL离心上清于EP管中，进行5min 95℃水浴处理；每个测定管需要设一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min 95℃水浴处理。
PPO活性计算：
1、血清（浆）或果汁PPO活性
单位的定义：每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化
0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/mL）=ΔA×V反总÷(V液× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷V液
2、组织、细菌或细胞PPO活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个
酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个
酶活力单位。
PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =60×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.12×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.08mL；V液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL；V样：加入样本体积，0.18mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
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