荧光定量全程详细讲解
荧光定量法
荧光定量法一、引言在生物医学研究中，荧光定量法是一种常用的实验技术，用于测量样品中特定物质的浓度。
荧光定量法基于荧光现象，通过测量样品发出的荧光强度来确定目标物质的含量。
本文将详细介绍荧光定量法的原理、应用以及优缺点。
二、原理荧光定量法基于荧光现象，即当物质受到激发光照射后，能够吸收光能并发出辐射光。
荧光现象是由于物质的电子在激发态和基态之间跃迁所导致的。
在荧光定量法中，使用荧光染料或荧光标记的抗体等荧光探针与目标物质结合后，通过测量荧光强度来确定目标物质的浓度。
荧光定量法的基本原理如下： 1. 激发：使用特定波长的激发光照射样品，使样品中的荧光探针被激发到激发态。
2. 荧光发射：被激发的荧光探针从激发态跃迁回基态时，会发出荧光。
荧光的波长和强度与样品中目标物质的浓度相关。
3. 检测：使用荧光仪测量样品发出的荧光强度，并将其与标准曲线进行比较，从而确定目标物质的浓度。
三、应用荧光定量法在生物医学研究中有广泛的应用，以下是一些常见的应用领域：1. 生物分析荧光定量法可用于测量生物样品中的蛋白质、核酸、细胞等目标物质的浓度。
例如，可以使用荧光探针标记的抗体来定量检测特定蛋白质在细胞中的表达水平，或者使用荧光探针检测核酸序列的浓度。
2. 药物研发荧光定量法在药物研发中起着重要的作用。
通过荧光定量法可以测量药物在体内的药物浓度，评估药物的代谢和排泄情况，从而优化药物剂量和给药方案。
3. 环境监测荧光定量法可用于环境监测中，例如测量水样中的污染物浓度。
通过使用荧光探针与目标污染物结合，可以快速、准确地测量水样中的污染物含量，为环境保护提供重要参考。
4. 食品安全荧光定量法在食品安全领域也有应用。
例如，可以使用荧光探针检测食品中的有害物质，如重金属、农药残留等。
荧光定量法具有高灵敏度和高选择性，能够有效地检测食品中的微量有害物质。
四、优缺点荧光定量法作为一种常用的实验技术，具有以下优点： - 高灵敏度：荧光探针的荧光强度可以非常敏感地反映目标物质的浓度变化。
荧光定量法
荧光定量法摘要：一、荧光定量法的概述二、荧光定量法的原理三、荧光定量法的应用领域四、荧光定量法的优缺点五、荧光定量法的发展前景正文：一、荧光定量法的概述荧光定量法是一种生物学研究中常用的实验技术，它的主要作用是通过检测荧光信号的强度，来定量分析样本中特定目标物质的含量。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和高重复性等优点，被广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫学等领域。
二、荧光定量法的原理荧光定量法的原理主要基于荧光信号的特性。
荧光信号是一种光信号，当特定波长的光照射在荧光物质上时，荧光物质会吸收光能，然后以另一种波长的光形式释放出能量，这种释放的光就是荧光信号。
荧光定量法就是通过检测这种荧光信号的强度，来定量分析样本中特定目标物质的含量。
三、荧光定量法的应用领域荧光定量法在生物学研究中的应用领域非常广泛，包括但不限于以下几个领域：1、基因表达分析：通过荧光定量法，可以定量分析基因的表达水平，以研究基因在生物过程中的作用。
2、蛋白质分析：荧光定量法可以用于检测和定量蛋白质，从而研究蛋白质的生物学功能。
3、细胞分析：通过荧光定量法，可以定量分析细胞的数量和活性，以研究细胞的生物学特性。
四、荧光定量法的优缺点荧光定量法的主要优点包括：高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物质；高特异性，可以针对特定的目标物质进行定量分析；高重复性，可以进行大量的重复实验。
然而，荧光定量法也存在一些缺点，例如：需要特定的实验设备，操作相对复杂；可能会受到荧光物质的毒性影响等。
五、荧光定量法的发展前景随着科学技术的发展，荧光定量法在生物学研究中的应用前景非常广阔。
未来，随着荧光物质的研发和改进，荧光定量法的灵敏度和特异性将会进一步提高。
荧光定量PCR原理及操作步骤.课件
THANK YOU
感谢观看
荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。
实验结果解读注意事项
数据解读与处理
荧光定量PCR实验产生的数据需要进行解读和处理。实验人员应熟悉数据分析方 法，正确解读实验结果，避免因数据处理不当导致误判。
结果报告与交流
荧光定量PCR实验结果应按照相关规定进行报告和交流。实验人员应确保结果的 准确性和可靠性，避免因结果报告不准确导致误导或决策失误。同时，实验人员 还应与其他相关人员进行有效沟通，共同探讨实验结果和问题解决方案。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
解决方案3
对于引物二聚体问题，可以通过优化引物设计、 降低引物浓度等方法来解决。
建议3
在实验前对引物进行充分的评估和验证，避免使 用易形成二聚体的引物。
问题解决方案及建议
解决方案4
对于假阳性结果问题，可以通过 增加重复实验次数、设置阴性对 照等方法来避免。
荧光定量PCR应用指南
荧光定量PCR应用指南荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR）是依靠荧光信号的强度来定量PCR产物的一种PCR技术。
该技术通过在PCR反应体系中添加特异性荧光探针，利用荧光信号的强度来反映PCR产物的数量。
荧光定量PCR在生物医学研究、基因表达分析、致病微生物检测等领域有着广泛的应用。
下面将介绍荧光定量PCR的原理、实验步骤和一些注意事项。
一、原理：荧光定量PCR最常用的荧光探针是TaqMan探针，TaqMan探针是由两个DNA引物和一个荧光标记的探针组成。
当PCR反应进行到延伸阶段时，引物和探针结合到靶序列上形成荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的强度可以定量PCR产物的数量。
二、实验步骤：1.设计引物和探针：选择特异性的引物和探针对目标序列进行扩增。
引物和探针的设计需要遵循一些原则，如避免引物和探针之间的自互补性、探针需选择合适的荧光染料等。
2.准备PCR反应体系：根据PCR反应需要，准备PCR反应体系。
一般包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液等。
3.荧光定量PCR反应：将PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，进行PCR反应。
PCR反应的条件需要根据目标序列的特性进行优化，包括温度、延伸时间等。
4.数据分析：通过荧光定量PCR仪记录荧光信号的强度，根据荧光信号的强度可以反应PCR产物的数量。
通过数据分析软件对荧光信号进行定量计算，获得PCR产物的数量。
三、注意事项：1.引物和探针的设计需要严格控制，确保其特异性，避免与非靶序列结合。
2.PCR反应的条件需要进行优化，不同的目标序列可能需要不同的温度、延伸时间等。
3.控制实验中的阳性对照和阴性对照，确保实验结果的可靠性。
4.严格遵守无菌操作，避免PCR反应体系受到外源性污染。
5.选择合适的荧光定量PCR仪进行实验，确保获得准确的荧光信号强度数据。
6.实验过程中需严格按照操作规程进行，避免操作失误对实验结果产生影响。
荧光定量法
荧光定量法是一种常用的实验技术，用于测量和定量分析样品中的特定荧光信号。
这种方法基于荧光分子的性质，通过激发样品中的荧光分子，并测量它们产生的荧光信号的强度来得出定量结果。
荧光定量法的基本原理是利用荧光分子的特性。
荧光分子具有吸收光子能量后发出比吸收能量低的荧光能量的特点。
当样品中的荧光分子受到特定波长的激发光照射时，荧光分子会吸收光子能量并跃迁到激发态。
随后，荧光分子会在极短的时间内从激发态返回到基态，并释放出荧光能量。
这个过程是一个自发发光的过程。
荧光定量法的步骤如下：1.激发光源：选择合适波长的激发光源，可以是可见光或紫外光。
根据需要，可以选择不同的波长来激发不同的荧光分子。
2.样品制备：将待测样品制备成适合荧光测量的形式。
这可能涉及到样品的稀释、提取或染色等处理。
3.荧光测量：将样品放置在荧光测量仪器中，通过激发光源照射样品，并收集样品发出的荧光信号。
荧光信号的强度与样品中荧光分子的浓度成正相关。
4.数据分析：使用合适的荧光定量软件或算法处理所得数据，得出目标物质在样品中的浓度。
荧光定量法具有以下优点：1.高灵敏度：荧光分子具有较高的荧光量子产率，荧光定量法能够检测到低浓度的目标物质，通常比其他定量方法更加灵敏。
2.高选择性：通过选择激发光源的波长和使用特定的荧光探针，可以实现对特定目标物质的选择性定量分析。
3.宽线性范围：荧光信号的强度与荧光分子的浓度之间通常具有良好的线性关系，可以实现宽范围内的定量分析。
4.实时监测：荧光定量法通常具有快速的响应速度，可以在实时监测过程中进行定量分析。
荧光定量法在许多领域中得到广泛应用，例如生物学、环境监测、药物发现和医学诊断等。
它可以用于测量蛋白质、核酸、细胞分子和微生物等生物分子的浓度，也可以用于测量环境中的污染物浓度。
由于其高灵敏度、高选择性和实时监测的特点，荧光定量法成为了研究和应用领域中不可或缺的工具。
总之，荧光定量法是一种基于荧光分子特性的定量分析方法。
实时荧光定量PCR详细操作步骤流程！
实时荧光定量PCR详细操作步骤流程！原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
步骤一、样品RNA的抽提1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12 000 rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。
混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE 中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul 取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
荧光定量pcr的原理和过程
荧光定量pcr的原理和过程荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的改进方法，通过引入荧光探针来实现对PCR反应的实时监测和定量分析。
荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等领域，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优势。
荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，都是通过不断复制DNA片段来扩增目标序列。
但是，荧光定量PCR在PCR反应体系中加入了特异性的荧光探针，这种探针能够与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号。
通过实时监测荧光信号的强度，可以准确地定量PCR反应中的目标序列数量。
荧光定量PCR的过程主要包括：样品制备、引物设计、反应体系配置、PCR扩增、荧光信号检测和数据分析等步骤。
首先，样品制备是荧光定量PCR的第一步。
样品可以是DNA、RNA或cDNA等，需要根据实验的目的选择合适的样品类型，并进行样品提取和纯化。
接下来，引物设计是荧光定量PCR的关键步骤之一。
引物是用于扩增目标序列的短DNA片段，通常由两个引物组成：前向引物和反向引物。
引物的设计需要根据目标序列的特点，如长度、GC含量、特异性等进行合理选择，并使用生物信息学工具进行引物序列的合成。
然后，反应体系配置是荧光定量PCR的另一个重要步骤。
反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核苷酸三磷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等组分。
其中，荧光探针是荧光定量PCR的关键组分，它通常由荧光染料和荧光信号抑制剂构成。
荧光染料可以与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号；而荧光信号抑制剂可以抑制未结合的荧光染料发出的背景信号。
接着，进行PCR扩增。
PCR扩增是通过不断循环进行三个温度阶段的反应来扩增目标序列。
首先是变性阶段，将反应体系中的DNA变性为单链DNA；然后是退火阶段，使前向引物和反向引物与目标序列特异性结合；最后是延伸阶段，聚合酶在适当温度下将dNTPs加入到引物结合的DNA链上，从而合成新的DNA链。
荧光定量pcr原理和步骤
荧光定量pcr原理和步骤荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，能够快速、准确地定量检测DNA或RNA的含量。
下面将介绍荧光定量PCR的原理和步骤。
荧光定量PCR的原理主要基于传统PCR技术和荧光探针技术的结合。
传统PCR通过不断复制DNA模板，使其数量呈指数增加，但并不能定量测定模板初始含量。
为了解决这一问题，qPCR引入了特定的荧光标记探针，该探针可与扩增产物特异性结合，通过荧光信号的增加来反映模板的初始数量。
荧光定量PCR的步骤如下：1. DNA模板制备：从待检测样本中提取DNA，并进行纯化处理，确保所得到的DNA质量较高。
2. 反应体系配置：根据实验需要，准备PCR反应液，包括DNA模板、引物（forward primer和reverse primer）、DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
3. 反应条件设定：根据引物序列的特性和所需扩增产物的长度，确定PCR反应的温度周期条件，包括退火温度、延伸时间和循环次数等。
4. 荧光探针设计：根据待检测序列的特点，设计合适的荧光探针，通常这些探针包括一个荧光染料和一个猪尾巴。
5. 温度循环程序：将配置好的PCR反应液放入热循环仪中，根据反应条件进行温度循环，使DNA发生退火、延伸和复性，并产生大量的扩增产物。
6. 荧光检测：热循环仪会不断读取PCR反应体系中荧光信号的变化，通过荧光强度来定量检测DNA的含量。
荧光信号的强度与模板DNA的初始含量成正比。
7. 数据分析：通过计算荧光信号和模板DNA的标准曲线，可以得到待检测样本中目标序列的初始含量。
8. 结果解读：根据数据分析的结果，可确定待检测样本中目标DNA的绝对或相对含量。
荧光定量PCR凭借其高度敏感和快速准确的特点，已广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传病筛查等领域。
随着技术的不断发展，荧光定量PCR将在医学诊断和疾病预测中发挥更加重要的作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
三、数据分析： 1、△CT=CT(样品)-CT(内参) 2、△△CT=△CT(样品)-CT(对照) 3、相对表达量=2- △△CT 在excell中 相对表达量=power（2，- △△CT ）
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
总分数在89，主要原因是GC含量差别太大，造成退火 温度相差太大，我们再点击编辑，进行修改，去掉其 中一个G，点击analyze—prime进行分析
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
一、引物的设计 1、注意事项： 发卡结构 引物二聚体 自我配对 引物的GC含量和退火温度 引物的长度、特异性 产物的长度
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
2、利用）
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
How many targets do you want to quantify in the reaction plate?
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
3、引物的特异性检测 通过ncbi中的blast数据库检测所涉引物的特异性， 网址：/Blast.cgi
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
4、将PCR管放入仪器的时候，要带新的一次性手套 5、仪器内8连管和96孔板使用不同的管架，主要区分 6、定量结束，禁止在大房间打开PCR管或PCR板 7、两次实验之间尽量至少休息半个小时，不要关机 关闭软件，待机休息 8、荧光定量PCR结束要及时关闭软件，防止长时间 在运作状态，对仪器电路板损伤比较大 9、设计程序时，溶解曲线后面加一步：温度降到 10-37℃之间，减少对仪器的损伤，
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
选择Primer---search，修改条件，点击两次OK
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
荧光定量PCR全程操作详解
报告人：宋瑞龙
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
一、引物的设计 二、RNA的提取 三、荧光定量操作
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛 中国Βιβλιοθήκη 命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
2、RNA的提取方法 （1）注意事项： 所用的枪头、离心管等与RNA接触的东西尽量避免RNA酶 的污染 操作时一定带口罩、手套、穿工作服（原因） 上清为RNA，中层为DNA，下层为蛋白质，要少吸取上清 ，不要贪多，避免将DNA吸进RNA中 提取的RNA要及时的转录一部分，剩余的放-80℃保存
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
三、荧光定量PCR操作 1、软件的设置：
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
切记：设计完成后要点击左侧的 对话框看看有没有设计错误，否则 你的样品可能因为你设计错了而毁掉
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
二、荧光定量PCR操作注意事项： 1、不要在荧光定量的八连管或者96孔板上做任何标记 2、加样之前要把可以混在一起的试剂尽量混合后加样 这样一方面可以节省枪头（6毛钱呀呀呀！！），另一 方面增加加样的准确性， 3、加样循序最好是SYBR先加，引物最后加，模板尽 量在引物之前添加，这样相同模板可以用一个枪头， 相同引物可以用一个枪头，还会减少误差以及操作带 来的溶解曲线的双峰
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
SCI文章中，荧光定量PCR可能会要到的数据： 1、RNA完整性检测 2、引物的好坏（荧光定量PCR中的溶解曲线） 3、CT值，通过CT得到的分析数据以及用以分 析数据的方法 4、退火温度，在文章中可能需要提一下
中国生命科学论坛-生命科学第一学术论坛
RNA切勿反复冻融。 在用trizol提取RNA过程中，加入氯仿后，用手剧烈摇匀 切勿用涡旋仪摇，避免不分层 RNA风干过程中，不要吹的太干10-15min左右 进行琼脂糖电泳的时候，加样量不要太多， （2）RNA提取的好坏主要看两个方面： 吸光度260/280=1.8~2.0之间 琼脂糖电泳：28S：18S～2：1，5s可多可少，无要求