南极磷虾胰蛋白酶的结构分析及适冷性机制研究
克隆技术研究论文3000字
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下面小编给大家分享克隆技术3000字论文，希望能对大家有所帮助！克隆技术3000字论文篇一：《试谈利用TAIL―PCR技术克隆南极磷虾胰蛋白酶基因》摘要：目的研究南极磷虾胰蛋白酶基因的全序列，为低温酶的基因工程制备建立基础。
方法以南极磷虾基因组DNA为模板，利用特异性的巢式引物和随机引物，通过交错式热不对称PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR) 克隆南极磷虾胰蛋白酶基因序列，并进行序列分析。
结果测序结果表明，南极磷虾胰蛋白酶基因序列全长961bp，其中含有开放阅读框(ORF)长度为798bp，编码266个氨基酸。
结论本实验成功克隆了南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步了解该酶的结构、功能和基因工程制备奠定了基础。
关键词：南极磷虾;TAIL-PCR;胰蛋白酶;基因胰蛋白酶是动物消化系统中主要的一种碱性蛋白水解酶，属丝氨酸蛋白酶家族，能专一性地水解肽链中赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键。
南极磷虾因其独特的生活环境，体内的胰蛋白酶具低温高效性，有研究表明，南极磷虾胰蛋白酶在37℃和1～3℃时的活性分别是牛胰蛋白酶活性的12倍和60倍[1]。
深入研究该酶对适冷性酶酶学性质的探究、蛋白质工程体系的完善具有极高的价值。
目前获得南极磷虾胰蛋白酶的方法主要是组织提取，这不仅步骤繁琐而且成本高昂。
本文旨在克隆南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步在工程菌中表达以大量获得南极磷虾低温酶奠定基础。
交错式热不对称PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction，TAIL-PCR)是一种快速有效扩增已知DNA序列侧翼未知序列的方法[2-3]，由Liu和Whittier[4]首次报道该技术。
南极大磷虾木瓜蛋白酶酶解产物氟浓度及营养成分研究
南 极 大 磷 虾木 瓜 蛋 白酶 酶解 产 物 氟 浓度 及 营 养 成 分 研 究
黄艳 青 ，龚洋洋 ，陆建 学 ， 房文红 ， 黄 洪亮
（ 中国水产科 学研 究院东海水产研究所 ， 农业部 东海与远洋渔业资源开发利用
重 点 实验 室 ， 上海 ２ ０ ０ ０ ９ ０ ）
摘 要 ：为 了解酶 解处 理对 南 极 大 磷 虾木 瓜 蛋 白酶 酶 解 产 物 （ 上 清 干 物质 Ｋ Ｓ Ｆ ， 沉 淀 干物 质 Ｋ Ｓ和残 渣 Ｋ Ｒ） 中氟浓度 的影 响 ， 采用 氟选 择 电极 法对 酶 解 产物 中氟进 行 测 定 。 同时 ， 采用 国
以干物质 重量计 算 ） 。计算 公 式 ：
在腹 壳、 尾 足 以及 头胸 部 ， 肌 肉 中 的 氟 含 量 最
命元素之一 ， 适宜含量 的氟对生物硬组织的建造
及促 进 生物 机体 生 长 、 发育 等 方 面 起着 其 他 元 素
低 ， 一旦 南 极 大 磷 虾 死 亡 ， 壳 中氟 会 很 快 渗 透
到肌 肉中 。因此 ， 南极大磷虾 中高氟含量是限
１ ． ４ 营养成分测定
对南 极大磷 虾 酶解产 物 Ｋ Ｓ和 Ｋ Ｓ Ｆ进 行粗 蛋
白、 粗脂肪 、 总 糖 测 定 。粗 蛋 白采 用 凯 氏 定 氮 法 （ Ｇ Ｂ ／ Ｔ ５ ０ ０ ９ ． ５—２ ０ １ ０ ） ｉ ９ １ ４ 定， 粗 脂 肪 采 用 索 氏抽
提法（ Ｇ Ｂ ／ Ｔ ５ ０ ０ ９ ． ６—２ ０ １ ０ ） 测定 ， 总 糖 测 定 采 用 分光 光度 法 （ Ｇ Ｂ ／ Ｔ ９ ６ ９ ５ ． ３ １ — ２ ０ ０ ８ ） 测定。
１ ． ２ 仪 器 设 备
南极磷虾壳氟赋存形态及其释放游离氟机制的研究
南极磷虾壳氟赋存形态及其释放游离氟机制的研究摘要南极磷虾资源蕴藏量巨大，生物量多达6.5-10.0亿吨，其作为潜在优质的动物蛋白源对缓解人类食物短缺具有重要应用前景。
南极磷虾活体氟含量高，分布不均匀，99%主要集中于虾壳，肌肉中含量少。
南极磷虾死后贮藏过程中，伴随着虾体自溶，虾壳中的氟以游离形态向虾肉发生迁移，造成虾肉氟污染而不能安全食用。
高氟是限制南极磷虾开发利用的瓶颈之一，阐明南极磷虾壳中氟的赋存形态及其释放游离氟的机制，可以从源头固氟，阻隔氟的迁移，有效抑制虾肉氟含量的升高，对促进南极磷虾资源的开发利用具有重大的理论价值和现实意义。
本论文首先对南极磷虾壳的微观结构及其氟赋存形态进行分析，然后对南极磷虾壳释放游离态氟的诱发因素进行筛选与甄别，筛选出了内源水解酶中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）和类胰蛋白酶是引起虾壳释放游离氟的主要潜在诱发因素，随后对NAGase和类胰蛋白酶进行分离纯化，并对其酶学特性进行研究，最后对NAGase和类胰蛋白酶引起南极磷虾壳释放游离氟的规律进行研究。
主要研究内容与结果如下：1、利用扫描电子显微镜（SEM）对南极磷虾壳的微观结构进行观察，通过核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和能谱分析（EDS）等多种分析手段对南极磷虾壳中有机态氟、无机结合态氟进行表征，在此基础上对南极磷虾壳中的氟进行分类。
结果表明：（1）南极磷虾壳的化学成分主要为蛋白质、甲壳素及无机盐；南极磷虾壳呈典型的分层结构，外层致密，内层疏松，α晶型的甲壳素纤维从分布在其中的孔道内伸出并扩展成层，多层堆叠构成虾壳的主体结构，甲壳素纤维上有结点，无机盐沉积在甲壳素纤维束上，蛋白质包裹在甲壳素纤维和无机盐表面并将其粘结在一起最终形成虾壳；（2）南极磷虾壳无机盐中无机结合态氟为氟磷灰石，不含其它无机氟化物；虾壳中不含有机氟化物，但含有弱结合态氟有机氟；（3）南极磷虾壳中的氟可分为游离态氟和结合态氟，其中结合态氟包括氟磷灰石形式存在的氟及与甲壳素、蛋白质等大分子以弱结合态存在的氟。
虾类胰蛋白酶的研究进展
从南极大磷虾蛋白酶中分 离出一种相对分 子量为 30 kD 的胰蛋白酶。 S j dah等 [ 17] 经过精确研究得到 南极大磷虾胰蛋白酶的相对分子量: TL I 25 02 kD, TL II 25 07 kD, TL III 25 06 kD。 2. 2 胰蛋白酶等电点的研究
采用聚丙烯酰胺凝胶电聚焦的技术手段, Sa inz 等 [ 15] 对南美白对虾 3种胰蛋白酶的等电点进行研 究表明, 3种胰蛋白酶 A、B、C 的 pI分别为 3. 5、3和 4. 5; 斑 节 对虾 两 种胰 蛋 白酶 等电 点 分别 为 2. 1、 2 4[ 11] ; Sa lam anca等 [ 16] 从南极大磷虾蛋白酶中分离 出的胰蛋白酶 pI为 4. 1。
胰蛋白酶作为动物体内重要的蛋白消化酶类, 研究者对于人类及陆生动物如鼠、狗、牛和猪等胰蛋 白酶的研究较多。近年来, 随着水产养殖业的发展, 虾类消化酶的研究也逐渐形成, 主要是研究对虾养 殖过程中不同饲料、生长阶段、水体环境下虾类消化 酶活性状况, 并以此为依据选择合适的虾类养殖条
件。关于虾类胰蛋白酶的基础性研究, 国外比国内 开展得早。迄今为止, 已研究报道了南极大磷虾、南 美白对虾、斑节对虾、印度对虾、东方扁虾、太平洋大 磷虾、凡纳滨对虾和中华齿米虾等虾类胰蛋白酶。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin
2011年第 2期
crangon总蛋白酶活性在 pH 5- 7之间活性很高, 且 最适 pH 在 5. 5- 6。 N avarrete del T oro等 [ 24] 报道了 欧洲龙虾 (钩虾 ) 的胰蛋白酶活性即使在酸性 pH 条 件下也可保持很高的活性, 且其活性可被胰蛋白酶 抑制剂完全抑制。 2. 4 胰蛋白酶最适温度的研究
南极磷虾酶解产物中一种含氟多肽的研究
无法科学的评估南极磷虾的安全性，因此研究南 极磷虾肌肉中氟的赋存形态是非常有必要的。
有关南极磷虾氟的分析方面，主要集中在对 氟的总量 分 析 上，对 氟 的 形 态 分 析 相 对 较 少，仅 有的几篇关于氟形态的报道也是基于土壤和岩 石中氟的形态分析方法［９］，并且通过这种分析方 法获得的几种氟形态存在交叉折叠，学术上尚存 在争议 ［１０］。目前 人 们 对 南 极 磷 虾 中 氟 形 成 机 制 尚不清楚，关于氟与蛋白存在某种形态结合以及 以何种方式结合，还处于假设推断状态。ＳＡＮＤＳ 等［１１］基于氟的快速溶解特性，推断氟可能与水溶 性蛋白结合在一起，ＺＨＡＮＧ等 通 ［１２］ 过对南极磷 虾氟的迁移规律研究，推断氟可能与某种结构蛋 白有关。笔者在前期的研究中也发现，南极磷虾 蛋白中存在结合态的氟，为了进一步获得南极磷 虾蛋白中氟的结合形态，本研究在酶解获得蛋白
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海 洋 渔 业
２０２０年
肽的基础上，参考相关蛋白分离文献［１３－１６］，采用 超滤、凝胶过滤层析，Ｃ１８高效液相色谱技术分离 纯化得到纯化的磷虾肽，然后通过离子色谱法对 其进行氟含量的测定，同时利用 ＬＣＭＳ／ＭＳ对其 氨基酸 序 列 进 行 分 析，将 分 析 结 果 通 过 ＮＣＢＩ ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＥｕｐｈａｕｓｉａｃｅａ蛋白质数据库匹配得到相 应的蛋白质，并对该蛋白结构与特性进行深入分 析，以期可为南极磷虾中含氟蛋白的制备提供新 的技术方法，同时也为南极磷虾中含氟蛋白的安 全评价提供技术支撑。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料 １．１．１ 南极磷虾来源
实验用南极磷虾于 ２０１７年 ４月采自南极海 域，采捕上岸后，放入 －２０℃的冰箱冷冻保存，运 回实验室后，于 －８０℃下保存备用。 １．１．２ 实验试剂
南极磷虾自溶过程蛋白质组分含量变化
南极磷虾自溶过程蛋白质组分含量变化黄显彬;曹荣;李智博【摘要】以南极磷虾为研究对象,分析了南极磷虾在4℃和20℃条件下自溶过程中非蛋白氮(NPN)、TCA可溶性蛋白、氨基酸态氮、总挥发性盐基氮(TVB-N)等蛋白质组分的变化情况.结果表明,南极磷虾NPN含量随着时间的延长而增加,8h后4℃和20℃试验组NPN含量分别为8.40和12.67mg/g,分别占到总氮的33.12％和49.96％;TCA可溶性蛋白的变化规律与NPN基本一致,而氨基酸态氮含量显著偏低;TVB-N值同样随着时间延长而增加,8h后4℃和20℃试验组TVB-N含量分别为0.16和0.21mg/g.在实际生产中,南极磷虾原料应尽量避免高温条件下长时间贮存.【期刊名称】《湖南农业科学》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】3页(P76-78)【关键词】南极磷虾;蛋白质;自溶;非蛋白氮【作者】黄显彬;曹荣;李智博【作者单位】大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116000;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛 266071;大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116000【正文语种】中文【中图分类】TS254.1南极磷虾（Euphausia superba）属于无脊椎动物中的节肢动物门、甲壳纲、软甲亚纲、磷虾目，广泛分布于南极水域，生物量达数亿t[1]。
随着近海渔业资源的日益减少，南极磷虾资源受到世界渔业发达国家的广泛关注，我国也极为重视南极磷虾的开发，并于2009年开始对南极磷虾进行商业捕捞和加工利用[2]。
南极磷虾富含优质蛋白，但体内含有活性很高的蛋白酶系[3]，南极磷虾起捕后会迅速发生自溶。
因此，南极磷虾捕捞后需立即冷冻或加工，但是遇到捕捞量集中的情况，南极磷虾往往得不到及时处理，会导致原料品质劣化[4]，造成经济损失。
南极磷虾蛋白质极易自溶的生物学特性严重束缚了资源的高效利用，对南极磷虾自溶机理与自溶过程的研究一直是国内外科研人员的研究热点。
关于南极磷虾问题的研究
远洋渔业概论报告学院：经济管理学院专业：会计14–4班姓名：李玉兵学号：1406160124关于南极磷虾问题的研究南极磷虾通常指的是南极大磷虾,是地球上已发现生物量最大的单一物种，其体长一般在5.6～ 6.0cm,是地球上数量最大，繁衍最成功的单种生物资源之一。
在南极生态系统中，仅南极磷虾这一种就足以维持以它为饵料的鲸鱼、海豹、企鹅的生存和繁衍。
根据最新估计，南极磷虾的生物量为6.5～10.0亿t,因其巨大的生物量和潜在的渔业资源，以及在南极生态系中的特殊地位而日益受到人们的注意。
其总量保守估计可达数亿吨，这一处于南大洋食物链的中心，是鲸鱼、海豹、企鹅等动物的主要食物。
全球的南极磷虾渔业每年约为10万吨，主要渔业国家为韩国，挪威，日本及波兰。
产物在日本主要用作为料理，而在世界其他地方则深加工为动物食品（虾油或虾干）及渔业饲料。
在全球渔业资源持续衰退的背景下，南极磷虾有望成为人类未来最大的蛋白质资源库。
南极磷虾是高蛋白质的食物，据生物学家测定，南极磷虾肉中含蛋白质17.56%，脂肪2.11%，且富含人体所必需的全部8种氨基酸，尤其是代表营养学特征的赖氨酸的含量非常丰富。
与金枪鱼、虎纹虾和牛肉相比，南极磷虾的赖氨酸含量最高。
世界卫生组织曾将南极磷虾、对虾、牛乳和牛肉的氨基酸综合营养价值比较评分，结果磷虾得100分，牛肉96分，牛乳91分，对虾71分。
国外科学家计算，一年捕捞7000万吨南极磷虾，即可为世界四分之一人口每天提供20克高质量蛋白。
磷虾与其他甲壳动物一样，也是通过脱壳来生长的，它们将阻碍身体增长的旧壳脱掉，在新壳尚未硬化前身体迅速膨胀。
南极磷虾的寿命一般为5～7年，2龄以后即成熟，体长最大可达到60mm以上。
夏季以捕食浮游生物为主,其它季节则以浮游动物为食。
分布的区域随季节和成熟期而有较大的变化。
主要的渔场在南极半岛附近,从初夏到盛夏(12—2月份)成熟的个体分布在大陆架的斜面上，而未成熟的个体则分布在大陆架的边缘。
南极磷虾酶解工艺的研究
南极磷虾酶解工艺的研究吕传萍;李学英;杨宪时;迟海;郭全友【摘要】以水解度为指标,探讨中性蛋白酶水解南极磷虾的效果,通过试验筛选木瓜蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶酶解南极磷虾的工艺条件.结果表明:南极磷虾自溶水解度为28.63％,添加中性蛋白酶可显著提高南极磷虾水解度；木瓜蛋白酶酶解工艺为酶解温度50℃ 、pH值7.5、酶解时间5h、酶添加量0.3％,水解度达(42.17±0.17)％；枯草杆菌中性蛋白酶酶解工艺为酶解温度50℃、pH值7.5、酶解时间5h、加酶量0.4％,水解度达(41.86±0.23)％.%By measuring the degree of hydrolysis (DH) as indicator, the hydrolyzation effect of Euphausia superba by neutral proteinase was discussed and the technological conditions for hydrolyzation of Euphausia superba by papain and Bacillus subtilis neutral proteinase were screened. The results showed that autolysis DH of Euphausia superba was 28.63% and DH of Euphausia superba could be improved observably by adding neutral proteinase. When the hydrolysis technologies of papain were enzymolysis temperature of 50t, pH 7.5, enzymolysis time of 5 h, and enzyme adding amount of 0.3%, the DH reached (42.17±0.17)%; when the hydrolysis technologies of Bacillus subtilis neutral proteinase were enzymolytic temperature of 50℃, pH 7.5, enzymolytic time of 5 h, and enzyme adding amount of 0.4%, the DH reached (41.86±0.23)%.【期刊名称】《湖南农业科学》【年(卷),期】2011(000)017【总页数】4页(P130-133)【关键词】南极磷虾;自溶;酶解工艺【作者】吕传萍;李学英;杨宪时;迟海;郭全友【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所,上海200090;上海海洋大学食品学院,上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,上海200090【正文语种】中文【中图分类】Q814.9南极磷虾资源丰富，据估计最高有数亿吨之巨[1]，具有极大的开发和利用潜力[2]。
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南极磷虾胰蛋白酶的结构分析及适冷性机制研究周婷婷，王锡昌，李燕（上海海洋大学食品科学与工程学院，上海 201306）摘要：本文基于酶的纯化鉴定、动力学分析、序列比对和结构预测，对南极磷虾胰蛋白酶的结构及适冷性进行研究，通过与其他几种适冷、中温胰蛋白酶进行差异性分析，探讨南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶在催化反应过程中应对低温环境的机制。
结果显示适冷胰蛋白酶和中温胰蛋白酶的催化中心严格保守，遵循一致的催化机制；但南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶为了适应低温环境，各级结构都表现出一定的应对机制：疏水性残基含量偏高、带正负电荷残基含量偏低，分子内部疏水作用增强、盐桥减少，这些因素致使适冷胰蛋白酶蛋白质分子内的相互作用减弱，分子柔性增强。
适冷胰蛋白酶具有更高比例的呈松散状的无规卷曲结构，一定程度提高了其柔性；底物专一性口袋周围空间位阻更小，底物更容易接近活性中心，这也是加快催化反应的关键因素。
关键词：胰蛋白酶；适冷性；酶动力学参数；南极磷虾；结构预测文章篇号：1673-9078(2016)5-27-33 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.5.05Structure and Cold-adaptation Mechanism of Trypsin Purified from theKrill (Euphausia superba Dana, 1852)ZHOU Ting-ting, W ANG Xi-chang, LI Y an(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)Abstract: The molecular characterization of trypsin purified from Euphausia superba (Dana, 1852) was investigated in this research. Aspects such as thermodynamic activation parameters, sequence alignment, and molecular model allowed an in-depth understanding of its activity at low temperatures. Conserved residues were compared between cold-adapted trypsin and its warm-adapted counterparts, and the results showed that their active cores were almost identical. Strategies adopted by trypsin for molecular adaptation to low temperatures may be as follows. A higher proportion of hydrophobic residues and lower proportion of charged residues in the enzyme probably diminish the number of intramolecular interactions, resulting in improved structural flexibility. Increased number of loose random coils may also contribute to improve structural flexibility. Reduced steric hindrance is also a key factor that allows the substrate to easily access the active site, thus promoting the catalytic reaction.Key words: trypsin; cold-adapted; enzyme kinetic parameters; Euphausia superba ; molecular modeling南极磷虾生活于南极冰下，资源丰富，我国于20世纪80年代中期开始对南极磷虾进行调查和研究，于2009年开始进行大规模的商业捕捞。
南极磷虾生活的水域温度一般维持在-1.7 ℃至-3 ℃，属于嗜冷水性动物，体内的酶普遍具有适冷性，在催化反应过程可能遵循着一定的应对低温环境的机制。
其体内高效的蛋白质降解酶系统主要分布于南极磷虾的胃和肝脏中，在较低温度下仍具有活性，能够迅速降解各种蛋白质，27收稿日期：2015-05-03基金项目：国家高新技术研究发展（863）计划海洋技术领域主题项目（2011AA090801）作者简介：周婷婷（1985-），女，博士研究生在读，研究方向：食品科学与工程通讯作者：王锡昌（1964-），男，教授，博士研究生，研究方向：食品科学与工程对复杂蛋白质的降解活性比所有的商品酶均高[1]；南极磷虾死亡后，即使在低温环境保存，虾体也易于自溶、变质、腐败，这些现象可能都与南极磷虾体内蛋白酶的适冷性有着密切的关系。
胰蛋白酶是甲壳动物体内主要的蛋白酶之一，能够专一性地切断多肽链中赖氨酸和精氨酸残基羧基端的肽键，Osnes 等[2]的研究表明，南极磷虾蛋白酶具有的高效催化性，大约40%来源于胰蛋白酶的作用。
适冷酶通过特殊的应对机制能够在低温环境下保持一定的活性，相对中温酶表现出了更加优越的催化性能，已被广泛地应用于食品加工和化工领域。
有研究表明适冷酶的某些氨基酸含有比例与其适冷性有着密切的关系；适冷酶关键氨基酸残基的取代可能会改变其局部区域分子间的作用力，使分子结构的紧密程度发生变化，从而影响到其在低温环境中的催化能力[3]。
在本研究中，基于酶的动力学分析、序列比对和二级、三级结构预测，对南极磷虾胰蛋白酶的结构及适冷性进行研究，通过与其他几种适冷、中温胰蛋白酶进行差异性分析，探讨南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶在催化反应过程中应对低温环境的机制，以期为其分子修饰及在食品和生物工程等领域的应用奠定基础。
1 材料和方法1.1 原料南极磷虾（2014年2月捕获于南极渔场48.1区），实验室-80 ℃低温保藏。
1.2 主要材料及仪器设备Superdex-75（GE）；Sepharose 4B（GE）；BApNA （SIGMA-Aldrich）；DEAE-Sepharose F. F. 预装柱（GE）；蛋白浓缩管（Millpore）；DW-86L626立式超低温冰箱（海尔集团有限公司）；SS250-E组织捣碎机（方胜电器实业有限公司）；冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂GL-20G-II）；电泳槽、电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像仪（Bio-Rad 公司）；MALDI-TOF/TOF质谱分析仪（Bruker Corporation）。
1.3 试验方法1.3.1 酶活及蛋白质含量的测定酶活的测定以BApNA为底物。
将50μL的酶溶液（浓度为0.1 mM）与50 μL 的10 mM BApNA溶液（50 mM Tris-HCl，pH 8.07）混合，37 ℃反应3分钟, 410 nm处测定吸光度值，每分钟记录1次，即测定产物对硝基苯胺在1分钟内的吸光度值变化量。
酶活力单位U(BApNA Unit) =Δ A410nm/( 10-6 × 8800) 其中∆A410nm表示样品1分钟吸光度值的变化量。
8800 M-1 cm-1表示产物对硝基苯胺的摩尔消光系数。
10-6表示单位mol 与μmol之间的转换值。
蛋白质含量测定方法参考福林酚法。
1.3.2 纯化和鉴定由30~70%硫酸铵分级沉淀获取的南极磷虾胰蛋白酶粗酶，经DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析（1 M NaCl 0~100%梯度洗脱，pH 8.07，1.0 mL/min）、Superdex-75 凝胶层析（50 mM Tris-HCl，pH 8.07，0.8 mL/min）和Benzamidine Sepharose4B 亲和层析（50 mM HCl, 0.5 mL/min）进行分离纯化，纯化样品收集保存于-80 ℃待用，取少量上SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度检测及分子量测定[4]。
纯化的南极磷虾胰蛋白酶在SDS-PAGE凝胶电泳胶条上显示为一条带，切取并用50% 乙腈和100mM 碳酸氢铵漂洗直至蓝色褪尽。
加入50 μL DTT对样品进行还原，加入100 μL乙腈脱水5~10 min；加入50 μL 碘乙酰胺进行烷基化，以便使酶切位点完全暴露。
利用测序级牛胰蛋白酶对处理后的样品进行消化，加入1% 三氟乙酸（TFA）提取肽片段。
取2 μL样品溶液加入2 μL 10 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液混匀，取上述混合液1μL点靶。
在室温条件下待样品干燥，500~1800 m/z的条件下进行质谱检测，方法参照Arvizu-Flores [3]。
1.3.3 动力学分析在37 ℃，pH 8.07反应条件下，选取浓度范围为0.05~1.00 mM的BApNA溶液为底物，每增加0.05 mM 底物浓度平行测定3次对应浓度的酶促反应速率，方法参照1.2.1。
基于Lineweaver-Buck 双倒数法作图得出样品K m和V max值，并以此计算K cat，K cat/K m。
1.3.4 序列比对及结构预测从NCBI数据中检索南极磷虾、温热带甲壳动物、寒带鱼类、温热带鱼类胰蛋白酶的由基因序列推测得出的蛋白质一级序列信息，通过ClustalX 2.0.12、DNAMAN进行序列比对分析；基于NCBI-Conserved Domains（/Structure/cdd/ wrpsb.cgi）对各序列的保守结构域进行分析，即对酶切位点、催化中心的活性位点及底物结合位点进行分析、对比。
基于ProtParam （/ protparam/）对各序列的氨基酸组成及相应蛋白质的理化参数进行检索、预测；通过PSIPRED（http://bioinf.cs. / psipred/）对蛋白质的二级结构进行预测并作差异性分析。
选取高分值模版，基于Swiss-Model （/）对胰蛋白酶进行建模，通过Swiss-PdbViewer软件展示其三维立体结构，并对适冷和中温胰蛋白酶的三维结构进行差异性分析。
1.3.5 数据处理酶活、蛋白质含量和动力学分析中酶促反应速率的测定每次做三个平行，结果取其平均值，并进行标准偏差分析。