基因工程作业之基因工程载体
基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
基因工程载体名词解释
基因工程载体是指能将分离或合成的基因导入细胞DNA分子，并在其中得以维持的DNA分子。
这些载体通常具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并保持其稳定性和表达。
基因工程载体的类型包括质粒DNA、病毒DNA和科斯质粒等。
其中，质粒是一种小型环状DNA分子，可以自我复制，并能够在细菌细胞中稳定存在。
病毒DNA则是一种感染细胞的病毒，其基因组可以插入外源基因并携带其进入细胞。
科斯质粒则是一种人工合成的质粒，具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并维持其稳定性和表达。
在基因工程操作中，载体被用来将外源基因导入受体细胞，并在其中表达。
通过使用载体，研究人员可以更容易地操作和调控基因的表达，从而更好地了解基因的功能和作用机制，为疾病治疗、药物研发等提供重要的支持。
第三章基因工程载体
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
基因工程载体的基本结构
基因工程载体是基因工程技术的核心组成部分，其基本结构对于成功进行基因转移和表达至关重要。
这些载体通常是DNA分子，具有特定的结构和功能，以便在宿主细胞中稳定存在并传递目标基因。
基因工程载体的基本结构通常包括以下几个部分：
复制起点：这是载体DNA复制的起始点，确保载体能够在宿主细胞中自主复制。
复制起点通常是来自病毒或质粒的序列。
选择标记：选择标记是用于在宿主细胞中识别和选择已成功导入载体的细胞。
常见的选择标记包括抗生素抗性基因和营养缺陷型互补基因。
多克隆位点：多克隆位点是一段位于载体上的DNA序列，用于插入目标基因。
该位点通常包含多个限制性内切酶识别序列，以便将目标基因方便地插入到载体中。
启动子和终止子：启动子是用于控制目标基因在宿主细胞中的表达的DNA序列，而终止子则标志着基因表达的结束。
这些元件确保目标基因在宿主细胞中以预期的方式表达。
复制子和原核序列：这些序列允许载体在特定的宿主细胞（如细菌）中复制和维持。
原核序列还为载体提供稳定性，并确保其在细胞分裂过程中传递给后代细胞。
此外，基因工程载体的设计还需考虑一些重要因素，如载体的大小、拷贝数、稳定性和毒性等。
为了获得理想的基因转移和表达效果，科学家们需要仔细选择和构建合适的载体，以满足特定的实验需求和应用场景。
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
基因工程第五章-载体
第一个经改造的认为 较完善的质粒载体是 pBR313, 他是松弛型 载体，引入了两个标 记基因------抗四环素 基因Tecr和抗青霉素 基因Ampr, 他的外源 基因插入位点在两个 抗性基因中
质粒的序列含有必要区和非必要区。
必要区指的是与质粒DNA复制有关的基因，他们对 质粒的存活、复制极为重要。
❖ 对于天然质粒来说，他们的基因中含有控制质粒分配的功能 区，细胞分裂构成中，这个功能区保证质粒拷贝被平均分配。
❖ 人工构建的质粒这个功能区已经缺失，因此，它在细胞分 裂中是随机分配的，尽管出现无质粒的细胞的几率较低，但 在一定的条件下，比如――－细胞分裂较快或营养缺乏的情 况下，会出现无质粒的细胞。
❖ COL质粒：1952年发现的大肠杆菌含有这一因子可编码一种奇 怪的蛋白质抗菌物质――大肠菌素。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
3. 引入多种用途的辅助序列，构建具有特化功能的载体：
构建质粒可用于组织化学方法的鉴定：pUC18载体带有 一个Lac操纵子的DNA区段，宿主细胞具有与之互补的基 因，当质粒进入宿主后，由于互补作用，而实现β－半乳 糖苷酶的表达（诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与操作 子脱离）。外源基因的插入会导致基因失活而检查重组子。
Section one
plasmids
一、质粒的生物学特性：
❖ 质粒最初发现于细菌中，是染色体外能自主复制的双 链共价闭合的环状DNA分子，是能够进行独立复制并 保持遗传恒定的复制子，大小在1――200KB。质粒 常含有一些编码对细菌生存有利的基因，比如说抗性 基因，降解复杂有机物的酶、细菌素，并且可赋予微 生物特殊的外形―――鞭毛、菌毛、芽孢等。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
《基因工程》第三章 载体2
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
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基因工程载体---乳酸菌表达载体pMG36e及其应用现状目前，多数外源基因的克隆与表达，主要采用大肠杆菌。
然而，由于大肠杆菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻，导致机体损伤，所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。
与之相比，乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且被公认为安全无毒的(Generally regarded as safe，GRAS)。
因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去上述复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗性作用。
乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌［1］，具有诸如缓解乳糖不耐症、调节消化道微生态平衡等益生作用，应用领域十分广泛。
随着近二十几年来分子生物学的发展，以乳酸菌作为宿主，利用质粒表达外源基因，对乳酸菌进行改造以进一步提高其功能已成为目前的研究热点之一。
乳酸菌常用质粒载体主要有pWV01衍生载体，pNZ系列载体［2］等。
质粒pMG36e来源于pWV01载体，于1989年由VanDeGuchte［3］以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成，质粒大小约为3.6Kb，便于宿主携带，可表达被克隆的各种基因。
目前已在乳球菌属（Lactotoccus），链球菌属（Streptococcus），乳杆菌属（Lactobacillus）等中成功表达如溶菌酶、苯丙氨酸氨酶［４］、枯草杆菌中性蛋白酶［５］，以及超氧化物歧化酶［６］等以及其他蛋白基因，近年来也有学者［７］对其进行改造，成功构建了食品级载体。
是目前应用较多的一个组成型表达载体。
本文主要从载体构成，表达外源基因与构建食品级载体等三方面进行综述。
一、载体的构成载体pMG36e由强启动子p32及其下游的部分开放阅读框、多克隆位点和来自乳酸乳菌乳脂亚种（Lactococcuslactissubsp.cremorisWg2）蛋白酶基因（prtP）［8］的转录终止子以及pWV01复制子和来自于质粒pE194［9］的红毒素抗性基因Emr构成，质粒大小为3.6Kb。
质粒pMG36e的构成使其有利于表达外源基因。
其中强启动子P32于1987年由VanderVossen等［10］利用鸟枪法从乳脂链球菌（S.cremoriswg2）克隆得到，p32包括开放阅读框架和一个能够被大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、乳链球菌（ctis）识别的核糖体结合位点。
pWV01复制子来源于广宿主乳球菌质粒pWV01［11］，能在一系列细菌中行使功能，这其中包括大肠杆菌（E.coli），枯草杆菌（B.subtilis）、乳球菌、乳杆菌、化脓性链球菌（S.pyogenes）和血链球菌（S.sanguis）等［3］。
位于翻译启始信号下游的多克隆位点可使外源基因在合适的阅读框架内插入。
由于大肠杆菌与枯草杆菌可作为构建重组质粒的中间宿主，这极大地提高了该质粒的表达效果和扩展了宿主应用范围。
二、利用pMG36e载体的基因表达自20世纪80年代VanDeGuchte成功构建该质粒以来，已利用该载体表达动植物和细菌的外源基因达十几种，并成功构建了多种具有特定功能的基因工程乳酸菌。
2.1细菌素基因的研究与抗生素相比，大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用，安全性比较高，因此对细菌素作用机制的研究有很重要的意义。
1996年，Franke等［12］用pMG36e表达与β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）融合的细菌素转运与成熟相关的lcnD基因，以研究乳球菌素运输机制。
Diep等［13］将载体pMG36e和其衍生载体pMG37e用于戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）细菌素诱导基因中的penIR和penIF的表达和免疫基因结构基因诱导基因簇peiA penA penI RKR的表达研究。
2007年该研究小组，又将pMG36e用于乳球菌素A（lactococcinA）研究，证明其利用甘露糖磷酸转移酶系统作为受体。
除此以外，pMG36e也用于植物乳杆菌素（plantaricin）423免疫蛋白的表达研究，和作为中间载体探讨乳链菌素（nisin）抗性机制以及用于表达肠道菌素（enterocin）AS48的as48ABCRNA 片段。
2.2酶类的研究2.2.1溶菌酶VanDeGuchte等［14］在成功构建质粒pMG36e后，插入一段母鸡溶菌酶（HEL）蛋白编码序列，构建质粒pMG36eHEL，通过使用兔抗HEL抗血清（蛋白印记法）在乳球菌中检测到符合预期大小（17KDa）的融合蛋白。
2.2.2几丁质酶1994年，Brurberg等［15］将革兰氏阴性菌粘质沙雷氏菌（SerratiamarcescensBJL2000）的几丁质酶基因克隆到乳酸乳球菌乳亚种MG1363和用于青储饲料的植物乳杆菌E19b（L.plantarum E19b）中，并得到表达，且具有抗真菌活性。
2.2.3其它酶类除此以外，先后有学者成功利用该载体在旧金山乳杆菌（L.sanfrancisco）、乳杆菌、乳酸乳球菌进行诸如α-淀粉酶、黑曲霉F246（Aspergillusniger，F246）、植酸酶phyA、人类谷胱甘肽Ｓ转移酶（glutathione S transferase）、木聚糖酶以及GFP等蛋白的表达［19～23］。
1990年，VanDeGuchte等［5］将枯草杆菌中性金属蛋白酶基因插入pMG36e，并将其转入到乳酸乳球菌乳亚种MG1363菌株，成功进行了表达并检测到活性。
2.3用于发酵乳制品功能性乳制品是指除具有一般乳制品固有的化学成分和营养作用外，还含有某些特殊营养物质或功能性成分，兼有一种或多种特定生理保健功能的乳制品［24］。
采用基因工程技术改良菌种的性状，是研发功能性乳制品的一个重要手段。
2.3.1 SOD发酵酸奶超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）是生物体防御氧自由基损伤的重要酶类，广泛存在于需氧生物、耐氧生物及某些厌氧微生物中。
SOD主要分为三类，即Fe SOD、Mn SOD和Cu/Zn SOD。
其中Fe SOD主要存在于原核生物，Cu/Zn SOD主要存在于包括人类在内的所有高等真核生物中，而Mn SOD则在高等生物的线粒体及细菌中［6］。
SOD具有有延缓机体衰老、抗电离辐射作用、增强耐缺氧和抗疲劳能力、促进婴幼儿生长发育、调节机体免疫功能、提高对炎症和肿瘤等疾病抵抗力等保健作用［16］，生产SOD乳制品具有重要意义。
1993年，Roy等［17］率先将大肠杆菌Mn SOD克隆到表达载体pMG36e，转化到携带SOD的乳酸乳球菌和缺乏SOD的加氏乳杆菌（L.gasseri）中。
我国学者［6,18］分别将在乳酸乳球菌与保加利亚乳杆菌（L.bulgaricusL6032）中实现人铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn SOD基因和大肠杆菌锰超氧化物歧化酶基因的表达，增强保加利亚乳杆菌对氧的耐受性，为下一步SOD发酵奶的研制奠定了基础。
2.3.2低乳糖乳制品发酵酸奶的过程中，在β-半乳糖苷酶的作用下，牛奶中只有25%～50%的乳糖被乳酸菌分解，还有较多的乳糖存在。
Wang等［19］利用质粒pMG36e将来自于保加利亚乳杆菌wch9901的β-半乳糖苷酶基因在乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363中表达，其后又将来自于德氏乳杆菌保加利亚亚种的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌中进行非融合表达。
使用具有半乳糖苷酶活性的乳酸菌生产乳制品，可为解决乳糖不耐症提供了方法。
2.3.3防癌保健乳制品谷胱甘肽硫转移酶（GST）家族是真核生物重要的解毒酶类。
人谷胱甘肽硫转移酶（hGST）对于多种来源的致癌物、诱变剂、具有重要的解毒作用。
向华等将人谷胱甘肽硫转移酶A1基因的cDNA序列亚克隆于表达载体pMG36e，获得hGST A1乳酸乳球菌表达株，可望应用于研制防癌保健乳制品。
2.4科学研究与基因治疗2.4.1研究益生作用机制由于很难检测体内吸附在肠上皮细胞的益生菌，因此，到目前为止都没有很好的方法来衡量其在肠道内的吸附能力，蒋爱民等利用pMG36e构建携带lux基因的重组质粒pMG36eluxAB和pMG36eluxCDABE，经电转化获得带lux基因的发光乳球菌。
这为研究体内益生菌的分布和存活率以及有利于人体健康的机制提供了思路。
2.4.2外源基因表达的报告系统Raha等将凝结芽孢杆菌ST 6（Bacilluscoagulans ST 6）中的聚糖酶基因亚克隆到载体pMG36e，构建了重组载体可作为大肠杆菌和乳球菌含报告基因的载体。
Duplessis等［20］利用pMG36e作为中间载体，通过构建pMG36eSapS研究了金黄色葡萄球菌非特异性酸性磷酸蛋白酶（nonspecificacid phosphatase）在革兰氏阳性与阴性菌中表达的报告基因。
2.4.3疾病治疗自1999年以来，有学者利用pMG36e构建携带有苯丙氨酸脱氨酶（PAL）的重组质粒，并得到具有一定酶活性的基因工程菌株，将其制成不同剂型灌喂高苯丙氨酸血症模型大鼠，发现其外周血苯丙氨酸脱氨酶水平显著降低，为基因疗法治疗苯丙酮尿症开辟了一条新途径［4］。
另外，pMG36e还应用于口服疫苗的研制，用于避免幽门螺杆菌的感染等。
三、食品级载体应用食品级载体（food-gradevector）是安全、稳定的，可在食品加工中使用的质粒载体。
它应具备以下基本条件：（1）选择标志必须是食品级的；（2）表达载体中的启动子、核糖体结合位点、终止子和分泌信号等DNA片段必须来自食品级微生物；（3）启动子的诱导物也必须是食品级的。
pMG36e参与构建食品级载体主要分为以下两种途径：一是表达外源基因作为食品级细菌素。
Mccormick等在表达载体pMG36e 中插入食肉乳杆菌素Carnobacteriocin B2的结构基因，转化到广布肉杆菌LV13菌中并获得表达。
Carnobacteriocin B2是一类小分子热稳定肽（SHSP），此类乳酸菌素杀菌机理主要是细菌素能吸附在细胞膜上并形成孔道，使得细胞膜的通透性增加从而引起细胞内各种离子的渗漏和能量物质的消耗，导致细胞解体死亡［21］。
二是用食品级基因代替pMG36e的抗性基因构建食品级载体。
Jenog以载体pMG36e为基础，使用来自于植物乳杆菌的α-半乳糖苷酶（aga）基因替换红霉素抗性基因作为选择标记，成功在乳酸乳球菌中构建食品级表达／分泌载体，该载体可用来生产食品或药品。