western blot实验经验总结
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
western blot经验
根据自己的实验体会，总结做好WB的一些心得，与大家分享，不当之处欢迎批评指正。
叙述的思路就是围绕着实验的每个步骤展开，这样可能更具体些。
1．配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。
常出现的问题有：A.凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮B.凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。
2．处理蛋白样品：该部分蛋白样品本身很关键，若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。
3．电泳:首先在跑积层胶时应尽可能使样品压齐，若上样量较大（如细胞蛋白通常上样在20-30甚至40ul）,可适当减小电压跑20-30min，待压齐后方可开始分离。
4．转膜:该环节电流的大小，转膜的时间决定是否能成功将蛋白转上，而具体的参数应取决于所要蛋白的分子量大小，应反复摸索，本人在实验中得出的经验为：10KDa:200mA 1h; 60KDa 70V,2h；90KDa 70V,4h；200KDa 70V,6h. 此外还有如下几个细节问题需要注意：A.膜的选择：PVDF还是NC,0.22μm还是0.45μmB.转膜液中甲醇的量：通常在10%-20%，蛋白分子量较大时可适当减少，蛋白分子量小时应适当增加，建议先从15%开始。
5．封闭:该步骤一般不易出现问题，常见的有室温2-3h，或者4度封闭过夜，但仍需强调一点的是有些抗体的使用需配套使用特殊的封闭液。
6．一抗孵育:通常购买到一种新抗体后，还是建议先按说明书推荐的浓度比例在室温孵育2-3h, 若该抗体效价较好，应该显带很漂亮，尤其是在抗体刚买时间不长，然而事情往往不能尽如人意，我们在遇到一个不好的抗体时该怎么办？可通过延长孵育时间（如：4度过夜孵育甚至室温过夜孵育），增大抗体浓度，如果你想尽了一切可能结果仍然很不理想，建议还是换抗体吧，不要再浪费时间与精力了。
western blot失败经验总结
western blot失败经验总结1我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。
有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。
另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1 ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。
这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。
最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。
western blot失败经验总结2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；2、转膜我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴＴＩＮＧ心得１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/m l) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。
Western Blot个人总结详细版
Western Blot—单层贴壁细胞蛋白提取及半干转法为例—中山大学临床检验诊断学硕士—刘记2016/11/141．蛋白制样A．贴壁单层细胞的处理：1）60mm细胞培养皿按200ul/皿，准备RIPA裂解液【6孔板100ul/孔，按底面积换算，用量不能过多，不然后续蛋白浓度过稀，无法保证15ul有足够的蛋白上样量】2）使用前将CockTail按1:100加入RIPA，混匀，冰上备用3）收取培养上清后，预冷PBS洗涤两遍【洗涤干净培养基，防止BCA培养基颜色干扰】4）200ul/皿，加入RIPA裂解液，冰上放置5分钟，轻晃使裂解液铺匀整个底面细胞5）冰上操作，细胞刮刷将细胞刮向一侧，加样枪收样到标记好的EP管，冰上放置6）离心，4℃，14000Xg，15min7）冰上操作，收上清至新标记好的EP管，冰上放置B．BCA测定蛋白浓度：按照碧云天BCA试剂盒说明书操作即可1）收取蛋白样品稀释10-20倍测浓度2）蛋白标准品在公用-20℃冰箱2层C．蛋白浓度调整：1）根据BCA蛋白浓度测定结果，按15ul上样体积【15-20ul】，40ug总上样量【30-100ug】，等体积，等蛋白量上样调整浓度至一致2）加入5XSDS蛋白上样缓冲液3ul，剩余12ul由上样蛋白和PBS补足3）按照计算好的每个15ul总体积需要加入的蛋白体积，PBS体积，5XSDS蛋白上样缓冲液体积，按6个15ul即90ul总体积，用量各X6配总体系【0.5mlEP管】，煮沸5min后再分装到每个小的EP管4）用0.5mlEP管配总体系，煮沸5min【使用0.5mlEP管，煮沸时不易进水】5）分装至0.2mlEP管【不要用0.2ml的EP管煮沸，易进水，改变总体积】，-80℃保存备用2．SDS-PAGEA．配胶【以1.0mm厚度mini胶为例】1）按照目的蛋白分子量大小选择适合浓度的分离胶2）选用新配置AP，4℃保存3）将玻璃板洗洁精洗涤干净，自来水冲洗干净，烘箱烘干备用；固定架上的软垫洗涤干净；梳子洗涤干净，烘干备用4）配胶用小烧杯洗净，倒扣纸巾吸干水滴，严格按照相应浓度分离胶的配方加入各种组分5）按照每块mini胶5ml用量配置分离胶，3ml用量配置浓缩胶6）加入TEMED后，迅速将分离胶倒入15ml离心管，迅速倾倒入玻璃板之间至绿色内边接近上缘，最后用1ml加样枪补加少量分离胶至绿色内边上缘【此步骤速度要快，防止凝固，导致分离胶上缘不平】7）尽快用1ml加样枪加无水乙醇进行液封，将分离胶上缘压平8）可观察配分离胶小烧杯剩余分离胶是否凝固，判断配胶是否出现问题，不凝固最常见问题是AP失效9）待分离胶与无水乙醇间出现明显分界线，5min左右，快速倒去无水乙醇，滤纸沿边缘吸干10）按照配方配置浓缩胶，加入TEMED后，用1ml加样枪迅速加满玻璃板，除去任何气泡11）将洗净的梳子迅速斜行划入，垂直压下，观察严禁梳子下方出现气泡，静置30min【跟室温和AP活性有关，可放入湿度温箱加速凝固】12）通过观察配浓缩胶小烧杯剩余浓缩胶的凝固情况判断配胶是否出现问题13）蛋白胶的保存，放入小袋，加少量单蒸水，保证胶润湿，常温保存可一周【4℃保存过久易出现裂胶】B．蛋白上样1）将配好的两块蛋白胶玻璃板用夹子夹在一起，小玻璃板向内，带字玻璃板向外，组成内电泳槽，放入大电泳槽，内外槽均加满1X的SDS电泳缓冲液2）在电泳缓冲液浸没的情况下，垂直向上轻轻拔出梳子【禁止干拔梳子，易致泳道破裂或粘合】3）蛋白上样，mini胶每孔上样蛋白体积最好15ul，最多不超过20ul，否则容易出现蛋白样品外溢，进入其它泳道或者曝光易出现β-actin的相连成线，上样预染蛋白marker，并记录蛋白样本次序，记住靠近marker的样本【若为了保证蛋白样本跑胶整齐不偏斜，可以在蛋白样本两侧各加一个泳道的蛋白marker，向内压】C．电泳1）按照对应红色黑色电极盖上电泳槽盖子，插上电极2）打开电源开关，调整电压80V，观察电泳槽出现小气泡上浮，证明正在电泳3）2h左右，观察溴酚蓝位置，待溴酚蓝刚跑出内电泳槽绿色底边时，终止电泳，关掉电源，拔下电极，盖子3．转膜-半干转法1）预先配好1L干转专用转膜缓冲液，向小瓷盘倒入一定量转膜液2）将干转专用滤纸两厚张浸入转膜缓冲液，准备干净的玻璃棒，镊子放入转膜液3）用绿色塑料小撬板将小玻璃板撬开，切除浓缩胶，立刻在分离胶一侧切除部分分离胶做标记，标注正面，如果分离胶底部出现一定量的溴酚蓝弥散，可以在玻璃分离胶之前，用手术刀片直接切除底部弥散溴酚蓝的分离胶；在电泳缓冲液里小心撬开分离胶，用撬板拖入转膜液内4）干转仪地面加少量转膜液润湿，从下向上一次放置滤纸，NC膜，分离胶，滤纸，每放入一层，立即用玻璃棒排出气泡，再加一定量转膜液；放下NC膜后即可用刀片在一角切除标记正面；放下分离胶之后，玻璃棒赶气泡时玻璃棒赶动方向应与蛋白泳道连线平行，轻轻赶动5）盖好转膜仪盖子，插上电极，打开开关，调整电压15V，40min，转膜4．封闭1）转模后，用镊子小心将NC膜取出2）在桌面保鲜膜上加少量TBST，按照预知的目的蛋白分子量KD大小，参照预染marker位置，用刀片切下NC膜，至少多切上下各1个marker位点3）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次4）用5%脱脂奶粉（TBST配置），在抗体孵育盒内，每个格子加入5ml，放入剪切好的NC膜5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时5．孵一抗1）回收封闭液，4℃保存，一周可反复用三次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用一抗专用稀释液稀释一抗【一抗稀释液碧云天购买或者用TBST配置5%BSA作为一抗稀释液】4）每格加入5ml一抗稀释液‘5）摇床，最小转速，4℃孵育过夜6．孵二抗1）回收一抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次，不少于6个月2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）用封闭液5%脱脂奶粉（TBST配置）稀释二抗4）每格加入5ml二抗稀释液‘5）摇床，最小转速，室温孵育2-3小时7．化学发光1）回收二抗稀释液，4℃保存，可反复使用多次2）摇床中等转速，TBST洗涤2次，10min/次3）1:1配置好化学发光工作液【碧云天】避光操作，避光保存；按每张膜1ml量配置4）带上镊子，干净玻璃平皿，1ml加样枪，枪头，发光工作液5）在化学发光仪上曝光拍照8．配置溶液1）10%SDS—用于配胶，常温保存2）AP—新鲜配置，4℃保存3）20%TWEEN—配置TBST需要使用4）转膜缓冲液—按照配方配置2X储存液，用前单蒸水稀释至1X5）电泳缓冲液—公用5X储存液，用前单蒸水稀释至1X，或者按配方自己配置6）TBS—商品化粉末溶解即可7）TBST—TBS和20%TWEEN配置8）配胶所需其他几种成分（30%丙烯酰胺，0.5M Tris6.8, 1.5M Tris8.8，TEMED），5XSDS loading buffer，TBS粉末，可以购买商品化产品9．注意事项小结1）电泳缓冲液可配置2X或5X，使用之前用单蒸水稀释至1X，最好不要用PBS稀释，影响组分及导电性2）转膜缓冲液最好自己配置，可配置2X，用前单蒸水稀释至1X，干转15V恒压时初始电流应在800-900mA才正常；若购买转膜液粉末需问清楚是湿转还是干转用途，湿转用转膜液，15V恒压转膜，初始电流300mA左右，不适合干转3）拔梳子禁止干拔，应夹好夹子完全浸没在电泳缓冲液中湿拔4）资料：转膜用NC膜不分正反面，注意孔径选择：0.45μm-大于20KD，0.22μm-小于20KD；自己实验证明统一选用0.45μm可以做出结果5）丽春红染色主要目的是NC膜上蛋白，判定是否成功转膜，并可助于染色条带剪切出目的蛋白位点的NC膜条带，剪下的NC膜用TBST洗涤去除丽春红染色，放入孵育盒开始封闭；丽春红染色步骤可以省略，前提是清楚确定目的蛋白所在位置6）封闭选用进口脱脂牛奶溶于TBST中配置5%脱脂牛奶，室温慢摇不少于2h7）一抗用一抗专用稀释液或者TBST配置5%BSA（不能用脱脂牛奶，易变质），4℃慢摇至少孵育过夜一抗专用稀释液稀释的一抗可半年内多次反复使用；一抗可4℃孵育过夜或两天，不影响效果8）二抗用封闭液稀释，室温慢摇不少于2小时9）每次更换孵育液前用TBST进行洗膜，10min/次，洗涤2次，快摇10）剪切好的膜放在抗体孵育盒内，进行封闭，孵一抗，孵二抗及洗膜过程中，不用拿出膜，可直接倾倒液体11）加发光液前，将NC膜从TBST洗涤液夹出，反面放在纸巾吸干液滴，不要正面摩擦纸巾，防止蛋白脱落。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。
2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。
3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。
在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。
2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。
3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。
4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。
总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。
在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
Western blot学习心得
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四蛋白质电泳
• 板子固定于电泳架→板子间加电泳缓冲液→上样→将板子放入 电泳槽中→倒入电泳缓冲液→加盖、插电源 • 1、玻璃板固定要注意小玻璃板向内，大玻璃板向外。 • 2、上样前一定要先加电泳液，将板子处在电泳环境中，起码没 过小玻璃板。电泳槽中按板子数量将电泳液加至2G刻度或4G刻 度。 • 3、将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。加样太快可使样 品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。 • 4、蛋白上样量一般20-50μg，按浓度计算上样体积，体积一般 不超过20μl。 • 5、样品两边要加Maker，以便于转膜时有清洗的界线。Maker 两边分别加2个孔的上样缓冲液，可减轻边缘效应。 • 6、电泳电压调至100V，电泳1小时。此为经验值，电压小，跑 的慢。观察溴酚蓝刚跑出可终止。
二蛋白质定量
• BCA蛋白质定量盒。按说明说操作。省略
三洗板子、灌胶
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western blot总结前人的经验
汇报人：
实验室安全规定：遵守实验室安全规定确保实验安全
操作规范：按照操作规范进行实验避免操作失误
防护措施：穿戴防护服、手套、口罩等防护用品避免接触有害物质
实验废弃物处理：妥善处理实验废弃物避免环境污染
实验室安全培训：定期进行实验室安全培训提高安全意识和操作技能
实验室安全检查：定期进行实验室安全检查确保实验室安全
汇报人：
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01
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03
04
05
06
蛋白质印迹：将样品中的蛋白质分离并转移到膜上
抗体结合：特异性抗体与目标蛋白质结合
显色反应：通过化学反应使结合的抗体显色
结果分析：通过显色区域确定目标蛋白质的存在和含量
孵育：加入一抗进行孵育
孵育二抗：加入二抗进行孵育
显色：加入ECL发光液进行化学发光显色
保存方法：根据试剂性质选择合适的保存方式和条件如冷藏、冷冻等
试剂有效期：注意试剂的有效期及时更换过期试剂
试剂污染：避免试剂受到污染影响实验结果
试Hale Waihona Puke 安全：注意试剂的安全性避免接触皮肤和眼睛必要时佩戴防护设备
试剂废弃：合理处理废弃试剂保护环境
样本选择：选择合适的样本类型和浓度
样本处理：对样本进行适当的处理如稀释、沉淀等
实验结束后应立即清理实验台面避免污染环境
实验废弃物应分类收集并按照相关规定进行处理
实验过程中产生的有害气体、液体等应进行有效处理避免对环境和人体造成危害
实验结束后应关闭电源、水源等确保实验室安全
实验安全：确保实验环境和设备的安全
实验记录：如实记录实验过程和数据确保可追溯性
实验伦理：尊重生命保护实验对象
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western blot实验经验总结1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。
原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。
在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。
Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。
我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。
具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。
揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。
western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。
我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。
效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。
如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。
只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。
2.Western Blot设备目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。
Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。
好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。
唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。
不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。
北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好，但能用，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。
3. Western Blot实验条件Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的，按以下的网址下载下来就可以了（/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。
具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。
丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货，配出来的胶可以提在手里玩，弹性非常好，价格比sigma的便宜许多，1公斤好像是480多人民币，够实验室用好长时间，现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶，很好用。
Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了，兰州的代理是上海生工。
要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。
转移电泳缓冲液可以回收再用两次。
转膜我通常是快转两百200毫安/2小时，慢转80毫安/12小时。
快转是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。
封闭我通常用BD的脱脂奶粉，不归，260元500克，也是从北京华美买的。
ECL我用pierce的，500毫升1650元，比国产的还便宜好用。
胶片是柯达的，以前用过乐凯的，不如柯达。
我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶，总觉得是脱裤子放屁的事。
4. Western Blot实验关键Western Blot操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，综合而言，抗体仍然是决定成败的关键，如果抗体很滥，就是神仙也没招。
其中内参抗体很重要，因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。
Actin，Tubulin，GAPDH我都用过，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，比较稳定的还是GAPDH。
如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做内参。
进口的，国内分装的，国产的，我都用过。
进口的最强的1:10000都能做出条带（Upstate，现在被Minipore招安了），国内分装的也好用，但就是不好回收重复使用，国产的一般只能用一次。
我要特别强调的是，实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体，因为只要Western Blot开工，每次都得用内参抗体，而一般目的蛋白的抗体也就用几次，重复三次就了事。
但内参抗体是不折不扣的耗材，严格意义上将，每跑一次胶，就得杂一次内参，使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。
我也自己制备过内参抗体，但好像因为种属同源性太高，背景总是不干净。
进口的好，太贵；国产的只能使用一次，年终算账，不比进口的便宜。
我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事，为什么国内企业高的早不了，低的造不好呢？现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗，200微升420元钱，我在蛋白上样量12微升/孔的情况下，按1:2000稀释比，条带非常清晰，没有杂带，是我目前用过的最好的国产抗体，我估计按1:4000照样能做出来，因为按按1:2000稀释做，在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。
抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交，可回收重复使用5到6次。
最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至（当时名叫杭州松华）发布的广告，我就怂恿实验室主管买了2支，很好用，现在实验室都没有用完；2009年我的一个朋友做western，我推荐他又买了1支，做出来的效果确实好，2009年底我到了新的实验室，western的全套我在新实验室重新建立，啥都采购齐了，可就是买不到杭州松华的内参抗体，我上网再也找不到这个公司的网页了，没办法，只好一直噌朋友的内参抗体用。
我有个陋习，就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。
还好，今年7月份我终于找到了当年的通讯记录，一联系才知道他们改名叫杭州贤至生物科技有限公司了，呵呵，改了个名，害我找了大半年。
第三次买到的GAPDH内参抗体，还是好用，1:2000，条带清晰，回收重复用，照样work，截止目前，我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的，嘿嘿！草根出生，我也照样有我穷人的劳斯莱斯。
5.关于奶粉，膜的选择和显影定影奶粉看似简单，其实很重要，如果要凑合，可以到超市买光明的脱脂奶粉。
奶粉质量不好，会最终导致显影要么漆黑一片，要么啥都没。
fluka的很好，可惜因为疯牛病的原因，现在海关禁止进口美国牛制品。
我现在用的bd的，很好很稳定，如果回收使用，500可以用很长时间。
细菌达到一定极限后，会导致tbst 里的奶粉变质，表现为发绿发臭，一种肉眼可察觉的淡淡的绿，一种鼻子凑过去能嗅出的臭，这时候就得扔了。
nc膜，pvdf膜我都用过，现在我已经固定下来用密理博的0.45微米的pvdf膜。
pvdf膜的好处是蛋白载量大，韧性好。
唯一的麻烦是事先得用甲醇泡几分钟，目的好像是为了增强膜的正电荷。
甲醇泡完后，得在转移缓冲液里泡一两分钟。
国内用nc膜的人多一些，主要是因为nc膜有分装的小片，忽悠老板买一张膜就100元钱，老板肯定乐意，若是说膜得花上千元，老板就有可能长时间的思考，然后过些日子再答复你。
所以大多数人会采取前一种方式，当然得告诉老板好几次，膜就100元钱。
我第一次用到pvdf膜是和好几个实验室合资买了一卷，我出了475元，类似于打的拼车的方式。
现在pvdf膜国内大概是1600元到1700元一卷，33厘米*375厘米，够好几个人用好长时间了，膜假货不多，至少我没有见过。
我们几个拼车的穷弟兄拿着尺子分赃的时候才发现本地供货商给我们送的货少了80厘米，嘿嘿，穷鬼撵着杀叫鬼，我们花钱容易吗！所以交涉，再交涉，直到他把我们的血汗膜返还才罢休。
现在我基本是从北京的欣津科和华美买，大概1700元一卷，完完整整。
0.45微米的pvdf膜我用5%的脱脂奶粉（溶于tbst中）室温封闭1小时，0.22微米的用8%的脱脂奶粉。
bsa我很少用，主要是bsa会出现封闭不均匀的情况。
我也很少用0.22微米的膜，原因是背景不干净，再者无论是封闭时间还是洗膜时间都得延长。
标准教程上推荐20kd以下的分子用0.22微米的膜，我杂过最小的分子是cleaved-caspase3,12ka，按我在一楼的转膜条件，在0.45微米的膜上清清楚楚。
我在上海的师弟他们转7ka的分子也用0.45微米的，没出过事。
废话一句，我师弟的实验室可是国家重点，那个富呀，让我闭上眼想想吧，那可是屎壳郎掉到了化粪池的感觉。
一抗我一般4度摇床过夜，洗膜3此，每次5分钟。
要注意的是，如果一抗里添加了叠氮化钠，务必洗膜5次，每次10分钟，因为叠氮化钠会灭活二抗偶联的辣根过氧化物酶（hrp）活性。
二抗我用的是中杉金桥分装的，120元一支，通常1:5000，室温1小时，然后洗膜三次，每次5分钟。
奶粉，一抗，二抗，我都回收，从开始到现在，一直如此。
因为我不敢忘记自己贼的出身。
我的一抗是国外的一位老师送给实验室的，刚开始的半年我啥都做不出来，以至于导师在平安夜领我到教堂祈祷。
上海的师弟知道后，每次裁膜的时候给我一小片一小片日积月累了一些，二抗只拿到了10微升，我怕实验室的人发现，一直是熬夜做western。
可最终还是因为我自己嘴不牢靠，导致东窗事发，师弟险些被开除，事情败露的那天，师弟在长途电话的那边哭，我在这边哭，写着写着，我的眼泪又一次的盈眶而出，说不出的辛酸与悲凉，师弟说他承担一切责任，让我装作不知道，那天晚上，我给他的导师写了一封长信，只求能保住师弟。
老天保佑，他导师让师弟写检查认错。
那以后，我再也没有让师弟为我偷过东西，我不能再为自己的理想让朋友付出代价。
虽然现在实验室的老板比较大方，我依然坚持着回收试剂的习惯，我始终不能忘记自己western blot的开始。