通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态和液态发酵中的
青霉素合成基因
将含有青霉素合成基因的DNA片段转入其它宿 主，宿主获得合成青霉素的能力
根据大量的实验结论，目前认为青霉素合成基 因的调控靠一些全局调控因子完成
已发现的全局调控因子
LaeA
Velvet复合物 PcRFX1
基因工程育种
育种历史
Fleming：2U/ml 产黄青霉NRRL1951:100U/ml
进展
1,3-diaminopropane和spermidine可以促进青 霉素合成基因的表达。其机制是促进laeA基因 的表达，由其合成的laeA介导激活青霉素合成 基因
penT通过促进苯乙酸和苯氧乙酸这两种前体物 质的跨膜运输来提高青霉素的产量
大肠杆菌青霉素结合蛋白PBP5：结合青霉素后 打开β-内酰胺环，令其丧失功能
4.将该阅读框构建入载体并转换大肠杆菌。实验 发现，含有该阅读框的大肠杆菌的培养液表现 出IPNS活性。对含有该阅读框的大肠杆菌培养 液进行SDS-PAGE，发现了与IPNS迁移率相同 的蛋白质
SDS-PAGE结果
该阅读框编码的蛋白质为IPNS。用此方法获得 pcbC 随后，pcbAB、penDE相继被克隆
先看看S. M. Samson, R. Belagaje, D. T. Blankenship, J. L. Chapman, D. Perry, P. L. Skatrud, R. M. Van Frank, E. P. Abraham, J. E. Baldwin, S. W. Queener等人的实验
把这种融合酶至于体外反应器，可不可以直接以α-氨 基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸为原料合成青霉素呢？ 这样的理论转化率可以达到100%
最新精选浙科版生物选修3 现代生物科技专题课后练习第六十七篇
最新精选浙科版生物选修3 现代生物科技专题课后练习第六十七篇第1题【单选题】为了防止转基因作物的目的基因通过花粉转移到自然界中的其他植物，科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中。
其原因是：( )A、叶绿体基因组不会进入到生殖细胞中B、受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞C、转基因植物与其他植物间不能通过花粉发生基因交流D、植物杂交的后代不会出现一定的性状分离比【答案】：【解析】：第2题【单选题】下列关于抗病毒转基因植物的叙述中，正确的是( )A、可以抵抗所有病毒B、对病毒的抗性具有局限性或特异性C、可以抗害虫D、可以稳定遗传，不会变异【答案】：【解析】：第3题【单选题】下列关于基因工程的叙述，错误的是( )A、用同种限制酶切割质粒和目的基因可获得相同的黏性末端B、基因工程培育抗虫棉的原理是基因突变C、cDNA文库中的基因不具有启动子和内含子D、外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达【答案】：【解析】：第4题【单选题】有关基因工程的成果及应用的说法不正确的是( )①用基因工程方法培育的抗虫植物和能抗病毒的植物?②基因工程在畜牧业上应用的主要目的是培育体型巨大、品质优良的动物?③任何一种假单孢杆菌都能分解四种石油成分，所以假单孢杆菌是“超级菌”④基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物．A、①②B、③④C、②③D、②④【答案】：【解析】：第5题【单选题】图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，Ne^r 表示新霉素抗性基因。
下列叙述正确的是A、图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团B、在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNAC、用PstⅠ和HindⅢ酶切，加入DNA连接酶后可得到1种符合要求的重组质粒D、导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长【答案】：【解析】：第6题【单选题】对基因组文库的描述，不正确的是A、含有某种生物的全部基因B、基因中含有启动子和内含子C、文库的基因是通过受体菌承载的D、文库中的全部基因可以在物种间交流【答案】：【解析】：第7题【单选题】如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
高中生物选修三“基因工程”综合练习(20题含答案)
高中生物选修三“基因工程”综合练习(20题含答案)高中生物选修三“基因工程”综合练习1. [选修三：现代生物科技专题]（15分，除注明外均为每空2分）请回答下列有关基因工程和胚胎工程的问题：（2）在基因表达载体中，启动子是_______________识别并结合的部位。
若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是______________。
（3）将目的基因导入微生物常用____________处理受体细胞，使之变成感受态细胞。
我国科学家发明的将目的基因导入植物细胞的方法是________________。
（4）研究还发现胚胎干细胞可以诱导分化为造血干细胞，这体现了胚胎干细胞具有__________。
临床上常用诱导干细胞定向分化的方法修补损伤或衰老的组织器官，从而解决了___________问题。
谜底：（1）PCR技术（1分）化学方法直接人工合成目的基因（2）RNA聚合酶大肠杆菌（或细菌）（3）Ca（或CaCl2）花粉管通道法（4）发育的万能性供体器官缺乏（或器官移植后免疫排斥反应）2. [选修三：当代生物科技专题]（15分，除注明外均为每空2分）荒漠齿肋赤藓具有超强耐旱能力的原因是其含有抗旱基因ScALDH21。
科研人员提出两种提高棉花抗旱能力的途径，回答下列相关问题:（1）第一条途径：利用酶从荒漠齿肋赤藓中提取目的基因，即。
科研人员将目的基因整合到Ti质粒的上，常利用法导入棉花的叶肉细胞。
最后，将含目的基因的棉花叶肉细胞培育成转基因植株。
（2）第二条途径：可通过技术获得荒漠齿肋赤藓与棉花的杂种植物。
在该方法中，荒漠齿肋赤藓细胞与棉花细胞融合前需用酶去除细胞壁，常用诱导两原生质体融合成杂种细胞的化学试剂为。
该技术利用的主要原理有。
答案：（1）限制（1分）抗旱基因ScALDH21T-DNA （或可转移DNA）农杆菌转化（2）植物体细胞杂交纤维素酶和果胶聚乙二醇（或PEG）细胞膜的流动性和细胞的全能性3. [选修三：现代生物科技专题]（15分，除注明外均为每空2分）逆转录病毒载体是目前应用较多的动物基因工程载体之一。
2023年高考生物真题模拟试题专项汇编：(15)基因工程(含答案)
（15）基因工程——2023年高考生物真题模拟试题专项汇编1.【2023年山东卷】“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。
下列叙述错误的是( )A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色2.【2023年湖北卷】用氨苄青霉素抗性基因（Amp R）、四环素抗性基因（Tet R）作为标记基因构建的质粒如图所示。
用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。
下列叙述错误的是( )A.若用Hin dⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落3.【2023年浙江6月】某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。
实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。
为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子4.【2023年北京卷】抗虫作物对害虫的生存产生压力，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。
为使转基因抗虫棉保持抗虫效果，农业生产上会采取一系列措施。
以下措施不能实现上述目标( )A.在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子B.大面积种植转基因抗虫棉，并施用杀虫剂C.转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植D.转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带5.【2023年新课标综合卷】某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。
【创新设计】2015-2016学年高中生物 专题一 基因工程 第2课时 基因工程的基本操作程序学案 新人教版选修3
第2课时基因工程的基本操作程序[目标导读] 1.结合教材P8图1—6，整体把握并说出基因工程的原理和基本操作程序。
2.尝试设计某一转基因生物(例如让大肠杆菌生产鼠的β珠蛋白)的研制过程。
[重难点击] 基因工程基本操作程序的四个步骤。
1．质粒作为载体所具备的条件(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA 进行同步复制。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。
(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
2．DNA的复制过程示意图DNA复制是一个边解旋边复制的过程，以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下，利用细胞内游离的四种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一段子链，复制结束后，一个DNA分子就形成了两个完全相同的DNA分子。
3．基因的表达是指某一基因通过转录、翻译合成相关蛋白质的过程。
[课堂导入]抗软化番茄是通过将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞培育而成的，具有抗软化、耐储存的优点，这种技术需要特定的操作程序，今天我们就来学习基因工程的基本操作程序。
探究点一目的基因的获取1．目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。
2．获取目的基因的常用方法(1)从基因文库中获取①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
②基因文库种类文库类型部分基因文库(如cDNA文库)基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以(2)利用PCR技术扩增目的基因①原理：DNA双链复制。
②过程：a ．变性：加热至90～95 ℃，使DNA 中的氢键断裂，双链解开。
新高考2023届高考生物一轮复习讲义第10单元第1课时传统发酵技术的应用发酵工程及其应用新人教版
第1课时 传统发酵技术的应用、发酵工程及其应用 课标要求 1.举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的。
2.阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品。
3.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。
考点一 传统发酵技术的应用一、发酵与传统发酵技术1．发酵的概念 发酵是人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2．传统发酵技术二、传统发酵食品的制作1．腐乳制作(1)原理：蛋白质―――→蛋白酶小分子的肽和氨基酸。
脂肪―――→脂肪酶甘油和脂肪酸。
(2)腐乳制作过程中参与的微生物：毛霉是一种丝状真菌，其繁殖方式为孢子生殖，代谢类型是异养需氧型。
2．泡菜的制作(1)乳酸菌发酵制作泡菜的原理：C 6H 12O 6――→酶2C 3H 6O 3(乳酸)＋能量。
(2)制作泡菜的方法步骤(3)泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化发酵时期乳酸菌乳酸亚硝酸盐发酵初期少(有O2，乳酸菌活动受抑制)少增加(硝酸盐还原菌的作用)发酵中期最多(乳酸抑制其他菌活动)积累、增多、pH下降下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)发酵后期减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动)继续增多，pH继续下降下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)变化曲线注意亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的深度思考①在泡菜制作过程中营造“无氧环境”的3项措施是什么？提示a．选择的泡菜坛要密封性好。
b.加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料。
c.盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。
②为什么泡菜坛只能装八成满？提示在泡菜发酵初期，由蔬菜表面带入的大肠杆菌、酵母菌等较为活跃，它们可进行发酵，发酵产物中有较多的CO2，如果泡菜坛装得太满，发酵液可能会溢出坛外。
另外，泡菜坛装得太满，会使盐水不太容易完全淹没菜料，从而导致坛内菜料变质腐烂。
农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量
农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量陈国枝;储炬【摘要】目的获得顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株,以阻断sorbicillinoids的合成,并研究其与头孢菌素C(CPC)产量的关系.方法通过根癌农杆菌转化法,依据同源双交换的原理,同时敲除合成sorbicillinoids骨架结构的两个聚酮合酶基因sorA 和sorB,并通过摇瓶发酵实验检测缺失菌和野生菌的产量.结果筛选并验证了6株A.chrysogenum-Apks菌株,遗传稳定,转化效率约为20％.通过发酵实验测定发现,缺失菌株产CPC能力比野生菌提高了70％.结论农杆菌转化法是一个高效的顶头孢霉遗传操作系统,并且顶头孢霉中sorbicillinoids的缺失可以提高CPC产量.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2019(044)007【总页数】6页(P805-810)【关键词】农杆菌转化法;顶头孢霉;聚酮合酶;同源重组;头孢菌素C【作者】陈国枝;储炬【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237【正文语种】中文【中图分类】R978.1顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)是β-内酰胺类抗生素的主要工业生产菌，其发酵产物头孢菌素C(CPC)经过化学法或者酶法处理可获得7-氨基头孢烷酸(7-ACA)[1]，后者是合成各种头孢类抗生素药物的母核物质。
2014年，Dominik等[2]公布了顶头孢霉野生型菌株ATCC11550的全基因组序列，使得从分子层面研究顶头孢霉基因功能更加便利。
原生质体转化法是顶头孢霉中最为成熟的遗传操作方法。
然而，由于顶头孢霉细胞结构复杂、分生孢子量比较少[3]等特性，其原生质体制备较为繁琐、困难。
同时，原生质体转化效率低下，使得顶头孢霉分子研究进程缓慢。
农杆菌转化法依赖于根癌农杆菌的侵染性，会将自身体内的Ti质粒的一部分基因转移并整合到宿主菌内。
青霉素概述教案
青霉素概述姓名：赵昱旭班级：制药1301 学号：2013003014青霉素（Penicillin，或音译盘尼西林）又被称为青霉素G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。
青霉素是抗菌素的一种，是指分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是由青霉菌中提炼出的抗生素。
青霉素属于β－内酰胺类抗生素（β－内酰胺类抗生素包括青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类、单环类、头霉素类等。
青霉素是很常用的抗菌药品。
但每次使用前必须做皮试，以防过敏。
以下为青霉素的主要介绍一青霉素的结构青霉素是6－氨基青霉烷酸苯乙酰衍生物。
侧链基团不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。
工业上应用的有钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐。
青霉素发酵液中含有 5 种以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F 和V 等），它们的差别仅在于侧链R 基团的结构不同。
青霉素的结构通式可表示为：二青霉素的医疗作用青霉素对溶血性链球菌等链球菌属，肺炎链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。
对肠球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、李斯特菌、钩端螺旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。
青霉素对流感嗜血杆菌和百日咳鲍特氏菌亦具一定抗菌活性，其他革兰阴性需氧或兼性厌氧菌对青霉素敏感性差.青霉素对梭状芽孢杆菌属、消化链球菌厌氧菌以及产黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用，对脆弱拟杆菌的抗菌作用差。
青霉素为以下感染的首选药物：1．溶血性链球菌感染，如咽炎、扁桃体炎、猩红热、丹毒、蜂窝织炎和产褥热等2．肺炎链球菌感染如肺炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等 3．不产青霉素酶葡萄球菌感染 4．炭疽5．破伤风、气性坏疽等梭状芽孢杆菌感染 6．梅毒(包括先天性梅毒) 7．钩端螺旋体病 8．回归热 9．白喉 10．青霉素与氨基糖苷类药物联合用于治疗草绿色链球菌心内膜炎，青霉素亦可用于治疗：1．流行性脑脊髓膜炎 2．放线菌病3．淋病 4．奋森咽峡炎 5．莱姆病 6．多杀巴斯德菌感染 7．鼠咬热 8．李斯特菌感染 9．除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染，风湿性心脏病或先天性心脏病患者进行口腔、牙科、胃肠道或泌尿生殖道手术和操作前，可用青霉素预防感染性心内膜炎发生。
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青霉素产量 第二组 World J Microbiol Biotechnol (2008)
青霉素 杀菌
影响青霉素产量高低
次级代谢
随机突变
优化
基因工程
结构基因(pcbAB, pcbC和penDE) 基因过表达
构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
结果与讨论
• 这与实验结果相符，菌株Wis 54-1255比P2-32 更接近于野生型，其由于额外拷贝的转入而导致 的在固态发酵中产量的增加比P2-32更高。相反 地，对于菌株P2-32，额外拷贝的转入则在液态 发酵中起到更加显著的作用。显然，在Wis中更 加保守的“固态培养基因”促进了其新的生物合 成能力在固态发酵中的发挥，而这些基因在菌株 P2中没有很好地保留（或激活）。另一项试验结 果也可用相同的原理来解释，那就是Wis在固态 发酵和液态发酵（培养系统）间产量水平的差别 在TW转化株上更加显著，而这种差别在P2转化 株上则较小。
结果与讨论
• 如前所述，P2-32转化株在液态发酵和固态发酵中均比 Wis 54-1255转化株显示出更高的青霉素产量的增加（相 比于其亲本菌株）。对这些结果有种与生物合成基因无关 的解释。P2是一个不断经过突变和筛选而得的高青霉素产 量菌株。这意味着它已经积累了很多突变，而很多这些突 变在功能上与生物合成基因不同但可以互补（附属基因）， 比如更高的输出能力。很多这类基因已被描述（Kiel et al. 2005; Lamas-Maceiras et al. 2006; Garcı´a-Rico et al. 2008）。这些突变使得更高的青霉素生物合成潜能得到 更好地表达（由于生物合成基因的扩增）。因此，已存在 于菌株P2中的互补突变必定使得菌株对通过增加青霉素基 因簇拷贝数后获得的更高的生物合成潜能进行更高效的利 用。
转化菌株 的菌丝体
接种了枯草芽孢杆 菌的胰蛋白胨 （1%琼脂）培养 基中
材料和方法
液态发酵
接种 （1×106）
取各菌株的孢子
每隔一定时间，取5毫升培养物
转接
作为副本
含有50ml复合 生长培养基 25oC, 50rpm
培养36小时
含有45ml复合 生产培养基
25oC,
250rp m培 养144 小时
材料和方法
固态发酵
经过0.3-0.6mm孔径筛过的甘蔗渣 改良的Somerson复合生产培养基
接种（ 2×106孢子/ml ）
初始的水分含量设定为70%
在每个Raimbault型圆柱发酵罐中加入12g固体培养基
25 oC条件下进行144小时，通气量设定为2.4L/h
取1克潮湿的培养 基样品测定其pH 值和青霉素含量
材料和方法
菌株
• 产黄青霉Wis54-1255——青霉素低产菌株 • 产黄青霉Wis54-1255 npe10——其青霉素基因簇不完整 • 产黄青霉P2-32——青霉素高产菌株 可容纳青霉素基因簇以串联重复的方式扩增数倍 • 产黄青霉CC 6633——用于在生物测定中评估青霉
结果与讨论
• 转化菌株Wis54-1255和P2-32被转移至腐草霉素浓度不断 增高的琼脂培养基上，以便选出含有高拷贝数的选择标记 基因ble的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因簇的菌 株。转化菌株中的6株Wis54-1255和3株P2-32可以在含有 60μg/ml腐草霉素添加剂的培养基上生长。
• 利用整套基因簇来增加青霉素基因的拷贝数而不 是转入单个的pcbAB和pcbC-penDE基因。
• 为实现这一目标，用分别位于基因簇的两个末克隆证实这两个探针都已分离 出来并获得了粘性质粒DNA。
结果与讨论
• 以此方式形成的重组粘性质粒继续呈递进行 Southern分析，分析中仍然使用相同的两个探针 以确定它们包含整套的青霉素基因簇。其中一个 名为IztapaCos-pen5的粘性质粒（图2 第5列）， 被用于转化产黄青霉。
结果与讨论
• 另外，本实验首次显示基因剂量的增加对固态发 酵中次级代谢物产量的提高也同样适用。在这点 上，可以预见本实验中提出的策略在其最有效的 形式下，也可用于其它更适用于固态发酵的实验， 如Barrios-Gonza´lez et al. (1993a)和Ban˜os et al. (2007)描述的那些。
整个的 基因簇 pcbAB– pcbC– penDE
产黄青霉（Penicillium chrysogenum）
上述研究均是利用产黄青霉Wis54-1255完成的， Wis54-1255仅含有一个青霉素基因簇的拷贝并且只能 产生少量的抗菌素，而且实验结果只适用于液态发酵。
本实验中，研究者对比了在转入整个青霉素基因簇后 低产菌株（Wis54-1255）和高产菌株（P2-32）青霉 素产量的差别，并且首次应用此法检测转化菌株在新 兴的固态发酵（SSF）技术（Suryanarayan 2003; Barrios-Gonza´lezand Mejı´a 2007）中的反应。
• 对原始和转化菌株的青霉素产量采用 Student’s T-test方法进行分析。
结果与讨论
• 在粘性质粒载体Izt入真菌之中，不需进一步的亚克隆。
• 首要目标——分离出一个含有整套青霉素基因簇 的粘性质粒克隆。
•
追求至善凭技术开拓市场，凭管理增 创效益 ，凭服 务树立 形象。2020年10月20日星期 二上午12时40分32秒00:40:3220.10.20
•
严格把控质量关，让生产更加有保障 。2020年10月 上午12时40分20.10.2000:40October 20, 2020
•
作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2020年10月20日星期 二12时40分32秒00:40:3220 October 2020
• 综上，本试验结果表明，不论对低产或高产的菌 株，尽管后者已经含有高拷贝的青霉素基因簇，
扩增青霉素基因pcbAB-pcbC-penDE的数量均会
使菌株在液态发酵和固态发酵中的产量得到提高。
小组成员
• 组长：陈静 • 第一篇文献翻译：张蕊、邢跃、张倩、张
晶 • 第二篇文献翻译：周建平、郝雅男、陈静、
素G的产量 和方法
质粒载体
IztapaCos
cos区 多克隆位点
腐草霉素抗性基因位点 （基因ble）——作为 真菌选择标记 删除PstI和XbaI的限制 性
全部DNA
提取
Sau3A1部分消化 去磷酸化
连接
IztapaCos 载体
BamHIXb 副本
于暗盒中在 -70oC条件 下用 HiperfilmMP胶片曝 光1小时
【通过PCR方法获得】 以TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT 和CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG 为引物，
• 同时利用在琼脂鞘上的发酵来检测所有转化菌株的青霉素 产量。检测中青霉素产量最高的菌株是对60μg/ml腐草霉 素有抗性的转化菌株。我们将此两种菌株中筛选出的青霉 素产量最高的转化菌株分别命名为TW和TP。
• 对液态发酵和固态发酵中TW和TP菌株的青霉素产量作了 仔细检测，并在同一实验中与其亲本菌株的发酵产量作了 比较。在亲本菌株内转入IztapaCos（空载体）作为对照， 该转化菌株的青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。
并包括基因pcbAB编码区的3’末端序列 和3’-UTR的起始序列
pbcAB探针
通过切口转移标记上α-32P-dCTP
penDE探针
【由HindIII酶切质粒pULJL33而获得】 大小为0.3kb ，包含基因penDE的3’ 末端序列
材料和方法
真菌的转化
碱裂解
E.coli
40kbp粘性质粒
30μg/ml 腐草霉素
取出并混匀圆形容器中的内容物
1700rpm离心20分钟，青霉素被抽提到0.1M的磷酸缓冲液中 从值而）使。样 取品60的微p升H提值取为物5.或5（其如稀果释有物必用要于可生加物入鉴H定3P。O4调节pH
材料和方法
数据分析
• 对于固态和液态发酵实验，实验结果为两 个独立实验的平均值，样品（整个培养瓶 或圆柱发酵罐）为一式三份。
结果与讨论
• 相对于亲本菌株，转化菌株TW和TP的青霉素产量在两种 培养体系中均有显著提高。然而，来源于菌株P2-32的转 化菌株TP的青霉素产量则提高的更多。
结果与讨论
• 关于产黄青霉( P. chrysogenum )青霉素产量的早期研究表
明微生物在固态发酵中的生理生化反应与在液态发酵中的大 不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。 这一信息指出了设计能够特别适合于固态发酵菌株的改进方 法的必要性（Barrios-Gonza´lez et al. 1993a; BarriosGonza´lez and Mejı´a 2007）。研究表明越接近于野生型的 菌株在固态发酵能越高效地发挥其青霉素生产潜力，这说明 在遗传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产菌株， 正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应 和生长的重要功能，（Barrios-Gonza´lez et al.1993a）。 寻找这些引起所谓的固体培养生理性的“固体培养基因”已 成为当前研究的主题（Barrios-Gonza´lez et al. 2008; Ishida et al. 2000; Te Biesebeke et al. 2005）。
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加强交通建设管理，确保工程建设质 量。00:40:3200:40:3200:40Tuesday, October 20, 2020
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安全在于心细，事故出在麻痹。20.10.2020.10.2000:40:3200:40:32October 20, 2020
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