ELISA步骤及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。
ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。
1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。
孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。
2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。
3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。
4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。
这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。
6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。
底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。
8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。
此步骤通常在一定时间后进行。
1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。
2.样品收集和处理方面要仔细。
避免样品的污染和交叉污染。
根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。
3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。
不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。
4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。
5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。
6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA
ELISA实验指导1．实验操作步骤：（1）包被：用包被缓冲液稀释PC，使其终浓度为20μg/mL，每孔100μL于96孔板（ELISA用），4℃孵育过夜。
（2）清洗：取出96孔板，倒置，甩掉孔中液体，并在纸上使劲拍掉黏附的剩余液体。
每孔加大约250μL的清洗液，37℃摇床中速孵育5min*3次，每次都要用力甩掉孔中液体。
（3）封闭：每孔加入100μL 封闭液，37℃摇床中速孵育1h。
（4）清洗：重复（2）（5）上样：LB稀释两倍上样，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h（6）清洗：重复（2）（7）一抗：将anti-strep按1：1000稀释比例稀释到1% BSA-TBS-Ca中，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h。
（8）清洗：重复（2）（9）二抗：按照1:6000将anti-mouse稀释到1% BSA-TBS-Ca中，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h。
（10）清洗：重复（2）（洗第三次的时候加入H2O2）（11）显色：稀释后的TMB显色，每孔100uL，室温避光孵育20min 左右。
（12）终止：每孔加100μL 1M 硫酸，显色终止。
（13）吸光值：终止后立即放入酶标仪检测吸光值（450nm，570nm）。
（14）数据处理：去除对照背景，计算实验结果。
2．实验试剂：（1）包被缓冲液：100mM Na2CO3，100mM NaHCO3，将两者分别配好，再将两者相互调配至pH9.6（2）清洗液：0.02% NP-40+TBS-Ca（10mM Tris，140mM NaCl，2mM CaCl2，pH 7.4）（3）封闭液：1%BSA，需用TBS-Ca 配置。
（4）样品处理：①非Ca螯合：50μL样品+10μL 10%BSA+40μL TBS-Ca②Ca螯合：50μL样品+10μL 10%BSA+10μL 100mMEDTA+30μL TBS-Ca（5）TMB：100μM，1mL DMSO，使用前需要稀释（1:100），稀释液为0.2M CH3COONa-柠檬酸，调至pH4.0，第三次洗的时候，按1：4229加入H2O2 （终浓度约为3mM）。
ELISA操作原理、步骤及注意事项
ELISA操作原理、步骤及注意事项优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液、分泌物和排泄物）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。
制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。
除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。
在ELISA中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。
2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3 加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。
加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析特定抗原或者抗体的存在。
本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 酶标仪3. 微量移液器和相应的可调移液器架4. 基质溶液（PBS等）5. 抗原或者抗体样品6. 酶标记的二抗7. 洗涤缓冲液8. 底物溶液9. 住手液三、实验步骤1. 准备工作a. 将96孔ELISA板放置在可调移液器架上。
b. 准备基质溶液，并将其加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，以避免溶液的蒸发。
2. 样品处理a. 将待测样品加入ELISA板的相应孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使样品均匀分布。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
3. 一抗孵育a. 将酶标记的一抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使一抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
4. 洗涤步骤a. 将洗涤缓冲液加入ELISA板的每一个孔中，每孔200μL。
b. 轻轻拍打ELISA板，使洗涤液充分覆盖孔底。
c. 倒掉洗涤液，重复以上步骤3次。
5. 二抗孵育a. 将酶标记的二抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使二抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
6. 洗涤步骤a. 重复步骤4中的洗涤步骤，以去除未结合的二抗。
7. 底物反应a. 将底物溶液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使底物均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
8. 反应住手a. 在适当的反应时间后，将住手液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在和浓度。
本文将介绍ELISA的操作规程，包括试剂准备、样品处理、板上反应、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，选择适当的缓冲液配方。
常用的缓冲液有PBS、TBST等。
按照配方将所需试剂溶解于适当的体积的去离子水中，并进行调节和混合。
确保所有试剂的pH值和浓度符合实验要求。
2. 标准曲线的制备：准备一系列已知浓度的标准样品，按照实验设计的需求进行稀释。
标准样品的浓度应该覆盖实验样品的范围，并且至少包含一个空白对照。
3. 酶标板的涂覆：根据实验需要，选择合适的酶标板（如96孔板），将需要检测的抗原或者抗体溶解在适当的缓冲液中，按照要求的浓度将其加入到酶标板的孔中。
尽量避免气泡的产生，并确保涂覆均匀。
三、样品处理1. 样品采集：根据实验目的，选择合适的样品类型（如血清、尿液、细胞上清等），并进行采集。
确保样品的采集过程符合规范，避免污染和损坏。
2. 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释。
通常，样品的初始浓度较高，需要进行多次稀释以使其浓度在标准曲线范围内。
3. 预处理：根据实验需求，对样品进行预处理，如去除杂质、离心沉淀等。
确保样品的处理过程不会影响到所需的分析结果。
四、板上反应1. 标准样品的加入：将标准样品按照实验设计的要求加入到酶标板的孔中。
每一个标准样品应该有至少两个孔进行重复测量，以提高结果的可靠性。
2. 样品的加入：将稀释后的样品加入到酶标板的孔中。
同样，每一个样品应该有至少两个孔进行重复测量。
3. 阳性和阴性对照的加入：为验证实验的准确性，加入阳性和阴性对照。
阳性对照顾该包含所需的抗原或者抗体，而阴性对照则不含。
4. 孔板的封闭：将酶标板封闭，避免样品的蒸发和污染。
可以使用密封膜或者盖板进行封闭。
五、洗涤1. 洗涤缓冲液的配制：根据实验要求，配制适当的洗涤缓冲液。
ELISA测定操作中的注意事项
ELISA测定操作中的注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的工具，用于测定病毒、细菌、蛋白质和其他生物分子在生物样本中的存在量。
ELISA检测方法操作相对简单，但仍然需要遵循一定的操作步骤和注意事项。
以下是ELISA测定操作中需要注意的几个关键点：1.准备工作：在进行ELISA测定之前，必须仔细准备实验室，并确保所有需要的试剂和仪器设备都得到妥善处理。
所有试剂应按照说明书储存和使用，并检查试剂有效期。
2.样品处理：样品的处理方法会因样品类型的不同而异。
无论是血清、尿液、细胞上清液还是其他类型的样品，都需要进行预处理以提取目标分析物。
必须注意避免样品污染和误导，以避免结果扭曲。
3.标准曲线制备：标准品的浓度应按照所需浓度系列依次配制。
标准曲线对于测量未知样品中目标物质的浓度至关重要。
应准确测量并稀释标准品，以保证标准品在适宜阶段内。
4.试板板块的涂覆：试板板块在试验中起到一个基础角色，对于测定结果至关重要。
在涂布之前，应完全清洗和干燥，以确保涂覆的均匀。
涂覆的目标抗体或抗原浓度也应该掌握好，以便获得准确的结果。
5.反应时间和温度：在试验进行过程中，应遵循说明书上的指导，严格控制每个反应的时间和温度。
反应时间和温度的变化可能会导致结果不准确或可读性差。
6.洗涤的重要性：洗涤步骤是ELISA测定中用来去除未结合的试剂或物质的重要步骤。
洗涤过程必须彻底，在每次洗涤中使用足够的洗涤缓冲液来确保彻底去除未结合物质。
7.底物的选择和反应停止：底物的选择对于结果的解读和显示至关重要。
不同的底物可能在不同的波长下显示颜色。
在选择底物时应确认设计好测定的波长。
同时，在底物反应后需要及时停止反应，使反应停止时间相对一致。
8.数据分析：9.消毒与废液处理：10.质量控制：为了确保ELISA测定的结果准确可靠，应进行质量控制。
包括使用质控样品、校准标准品和内部参比物来保证所得结果的精确性和可重复性。
总结起来，ELISA测定是一种有效的生化实验方法，但在操作过程中需要注意细节和实验操作的准确性。
elisa法检测步骤
elisa法检测步骤ELISA法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用于检测特定抗原或抗体的方法。
它基于免疫学原理，通过特异性抗体与抗原结合并利用酶的催化作用产生可测定的信号，从而实现对目标物质的定量检测。
下面将介绍ELISA法的基本步骤以及注意事项。
1. 抗原或抗体的固定需要将待测抗原或抗体固定在固相载体上，常用的载体有微孔板等。
固定的目的是为了使待测物能够与特异性抗体或抗原结合，并保持其稳定性。
2. 阻断非特异性结合位点在固定的抗原或抗体上，加入一种阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼胶蛋白（Gelatin），以防止非特异性结合。
3. 特异性抗体的结合将待测样品加入到固定的抗原上，使其中的抗原与特异性抗体发生结合反应。
特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据具体实验需求。
4. 酶标记二抗的结合经过特异性抗体的结合后，再加入酶标记的二抗。
酶标记的二抗与特异性抗体的结合形成免疫复合物。
5. 酶底物的加入在免疫复合物形成后，加入酶底物。
酶底物与酶标记的二抗结合后，酶会催化底物的反应，产生可测定的信号。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
6. 反应停止根据酶底物的选择，选择合适的反应停止液，使酶催化反应停止。
常用的反应停止液有硫酸或碳酸氢钠。
7. 信号检测将停止反应后的溶液转移到酶标仪或光度计中，测定产生的信号强度。
ELISA法可以通过颜色反应或发光反应来进行信号检测。
ELISA法作为一种常用的检测方法，在临床诊断、生物医学研究和生物工业等领域都有广泛应用。
但在进行ELISA实验时，还需要注意以下几点：1. 严格控制实验条件，包括温度、时间和pH值等，以确保实验结果的准确性。
2. 选择合适的阳性和阴性对照，以验证实验的可靠性和敏感性。
3. 遵循操作规范，注意实验操作的无菌和无污染。
4. 合理选择稀释倍数，以保证实验结果在检测范围内。
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1.蛋白包板：选择合适的蛋白包被浓度梯度，计算上样体积并用包被液稀释（50 μl/孔）。
2. 4 ℃过夜或者37 ℃孵育2 h。
3.用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
4.封闭：
（1）新配1～2% BSA或5% 脱脂奶粉（都用PBS配制）
（2）上样量100μl/孔
（3）37 ℃孵育1～2 h
（4）作用：封闭未被蛋白结合上的位点，防止待测抗体与板上空白位点的结合，减少非特异性反应。
5．用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
6. 封闭期间完成一抗的浓度梯度选择和稀释:
（1）用新配1% BSA 对一抗进行稀释（BSA可以中和一抗中可能存在的抗BSA的抗体，降低非特异性反应），计算所需稀释液体积后配制。
（2）上样量50μl/孔
（3）空白对照和阴性对照孔加等体积PBS
（4）37 ℃孵育1 h
7．用PBST洗涤3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
8. 一抗孵育期间配制酶标二抗稀释液
（1）用新配1% BSA进行稀释，计算所需稀释液体积后配制（一般1:5000）
（2）上样量50μl/孔
（3）阴性对照孔也加等体积二抗稀释液
（4）37 ℃孵育45min～1 h(同一批次二抗孵育时间必须固定，如1h)
9. 用PBST洗涤3～4次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
10.显色：
（1）A液和B液等体积混合，在使用前需在室温下放置30 min。
（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（A：B= 5ml: 5ml）
（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积显色液
（4）显色液上样速度一定要快速并保持匀速
（5）37 ℃孵育10 min或者室温避光15 min(从加完第一块板即开始计时)
11.终止：
（1）2M H2SO4作为终止液
（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板
（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积终止液
（4）终止液上样速度一定要快速并保持匀速
12.读数，分析数据
于酶标仪测得各孔OD值（终止后10min内），分析处理数据
(一)注意事项
1.加样
在ELISA中除了包被外，一般需进行4－5次加样。
在定量测定中加样量应力求准确，标本和结合物的稀释液应按规定配制。
加样时不可太快，应将液体加在孔底，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。
加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性；
加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附；溅出会对邻近孔产生污染；出现气泡则反应液界面有差异。
2.保温
在ELISA中一般有二次蛋白抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。
各ELISA板不应叠在一起。
为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。
湿盒应该是金属的，传热容易。
如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。
加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。
如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。
3.洗涤
洗涤在ELISA过程中，有时是决定实验成败的关键。
洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相蛋白或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。
因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。
另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；
③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。
洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。