(整理)westernblot参考资料.
Western Blot(PVDF膜)
美国芝加哥大学分子肿瘤实验室提供一、准备试剂：1、 TBST (Tris-Buffered Saline-Tween-20):10mM Tris-HCl (pH8.0)150mM NaCl0.05% Tween-20 (after all and water are mixed, add tween-20)2、 Transfer Buffer:800ml 甲醇（终浓度为20％）12.12g Tris Base57.63g 甘氨酸加入ddH2O 使总量达到4L注意：最终pH 值应该是8.3~8.6, 但不能通过加酸或者碱来调节。
二、实验步骤（一些具体步骤可以参考NC膜的方法）：1、首先，将蛋白质样品在SDS-PAGE胶中进行电泳（180V，30mA）。
2、将转移膜（PVDF）在甲醇中浸泡1分钟后，去离子水中洗涤3次，浸泡于转移缓冲液中待用。
3、组装转移组合，顺序如下：负极起：塑料底垫——底层泡沫——滤纸——SDS-PAGE胶————滤纸——上层泡沫——塑料底垫注意：应该绝对避免层与层之间有气泡的现象。
4、将转移组合放入转移电泳槽中进行蛋白质转移（4°C最佳）。
转移条件为：250mA ，60-100 minutes 。
5、转移完成后，将取出，采用封闭液(5-10% milk-TSBT) 在摇床上封闭2小时或过夜。
6、准备一抗：按一般推荐比例1:500-1:1000将一抗稀释在封闭液中。
7、将直接放入一抗-封闭液混合液体中，液体能够覆盖膜表面即可，室温下在摇床上震荡1-2小时。
注意：绝对避免让膜变干的现象8、使用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
9、准备二抗：按一般推荐比例1:5,000-10,000将二抗稀释于TBST缓冲液中（二抗直接联结于辣根过氧化酶HRP）。
10、将放入二抗-TBST混合液中，室温下在摇床上震荡1小时。
11、使用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
12、显色：按照显色底物说明配制HRP反应底物，将放入显色底物中，反应1分钟后取出。
Western Blot(免疫印迹法)
Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：⏹样品制备⏹电泳分离⏹蛋白的膜转移⏹免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂⏹1X 磷酸盐缓冲液(PBS)⏹Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM⏹1X SDS 样品缓冲液62.5 mMTris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT,0.01% w/v溴酚蓝⏹转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)⏹10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6⏹脱脂奶粉或BSA⏹甲醇⏹TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20⏹封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA⏹一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
⏹预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
WesternBlot蛋白免疫印迹法
3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。
0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。
2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。
68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。
3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。
避光，4℃保存。
（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。
5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。
6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。
调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。
7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。
充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。
使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。
8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。
室温保存。
10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。
(完整word)Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液（Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15。
1g Tris碱和72ｇ甘氨酸,5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310％ SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate ,SDS,C12H25O4NaS）溶液： 10g SDS，100ml去离子水配制,50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存.4Tris。
HCl的配置注：Tris的分子量是121。
4。
4度储存。
5 10％ APS (Ammonium persulfate ；过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml,分装到1。
5ml微量离心管中,负30度冻存.使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月.负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6,室温储存。
7 TBST (Tris—buffered saline with Tween20）的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。
8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12。
8ml，巯基乙醇3。
2ml，0。
05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1：2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20—25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×）调pH到6。
整理）WesternBlot操作步骤
整理）WesternBlot操作步骤Western Blot⽬录Western Blot (1)⼀、所需试剂 (2)1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (2)2、电泳液（可回收使⽤2次）:配⽅见三 (2)3、电转液：配⽅见三 (2)4、TBST（4℃避光保存）：配⽅见三 (2)5、4X Laemmli样品缓冲液（-20℃保存） (2)6、10-180kda 蛋⽩marker（-20℃保存1年，4℃3个⽉） (2)7、转印 (2)8、封闭和孵育（均可⽤5%脱脂⽜奶） (2)9、HRP发光液： (2)10、抗体： (2)11、蛋⽩印迹膜再⽣液 (2)12、其他： (2)⼆、具体步骤 (2)第⼀天： (2)1、灌胶 (2)2、配制电泳液、电转液各2L，配制TBST 1L（Tween 在需要使⽤时加⼊） (3)3、6孔板培养处理细胞（按处理细胞所需时间提前准备），提取蛋⽩ (3)第⼆天 (3)1、对蛋⽩样品进⾏定量以及配制上样量（包括marker直接20µl），将⼀抗复温。
(3)2、安装跑胶装置，去除梳⼦，上样，设置参数（根据⽬的蛋⽩⼤⼩确定）： (3)3、电转膜： (3)4、免疫杂交反应 (3)第三天： (3)5、显影（1cm2膜使⽤0.1mlHPR发光液） (3)三、各种配⽅及注意事项 (4)1、不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围： (4)2、不同浓度分离胶配⽅（其他见说明书）： (4)3、浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)配⽅： (5)4、电泳缓冲液配⽅： (5)5、电转缓冲液配⽅ (5)6、TBST配⽅ (5)7、试剂使⽤注意事项： (5)8、发光液的原理： (5)9、再⽣液注意事项 (5)⼀、所需试剂1、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（1）30% Acr-Bis (29:1)（4℃避光保存）：Acr丙烯酰胺；Bis亚甲基双丙烯酰胺，两者⼈⼯聚合成聚丙烯酰胺。
（2）1M Tris-HCl, pH8.8（室温保存）：缓冲溶液，Cl-可作为前导界⾯，⽤于配制分离胶（3）10% SDS（室温保存）：⼗⼆烷基硫酸钠，是⼀种阴离⼦去污剂，带有⼤量负电荷，可以使蛋⽩⾮共价键打开，并结合在蛋⽩质分⼦上掩盖蛋⽩间的电荷差异（4）Ammonium persulfate (过硫酸铵AP)（配成10%溶液分装20℃保存）：该系统的引发剂，可以释放硫酸根⾃由基，使丙烯酰胺单体等断裂聚合城聚丙烯酰胺（5）四甲基⼄⼆胺（TEMED）（4℃避光保存）：该系统的加速剂，在光照下裂解成⾃由基，加速聚合。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
(最新整理)westernblot详解
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至
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20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵
①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。
②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
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具体情况依照说明书
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灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓 慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左 右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。 沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形 。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
制作标准曲线 （插入表格）
检 测 样 品 蛋 白 含 量 ： 取 一 管 考 马 斯 亮 蓝 +95 l
(完整word版)WesternBlot结果条带全面分析
Western Blot 结果条带全面分析Q1。
啥也没有［原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片,最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了,比如兔的加成鼠的。
[解决办法］：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题.[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有,如果是这样大部分情况是抗体加错了。
如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低,ECL发光液失效.另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片.Q2。
高背景[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够［解决办法]：降低一抗浓度,增加洗膜时间和次数.[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。
其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免,洗膜按照规定来5min*5次或者10min＊3次,不要改成5min*3次，或者10min＊2次。
Q3. 非特异性条带[原因]：一抗非特异性与蛋白结合[解决办法]:更换一抗[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。
如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。
当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合.Q4. 条带中出现边缘规则的白圈［原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。
[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡[经验］：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡,可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。
然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下,然后盖上海绵.注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。
Western Blot
Western Blot （蛋白印迹技术）实验器材和试剂：制胶用设备（玻璃板，卡槽，梳子），电泳槽（专用），塑料挡板，3层滤纸硝酸纤维素膜，50ml tube（配制分离胶专用），15ml tube（配制浓缩胶专用），海绵垫，塑料饭盒，剪刀，玻璃棒，镊子，干式恒温加热器，移液枪及pipette，转膜夹板，X胶片，冰盒，泡沫盒电泳缓冲液，转膜缓冲液，蛋白样品，marker，10%BSA，一抗，二抗，底物反应液（高灵敏发光试剂盒），Tris-HC（PH=8.8），Tris-HCL（PH=6.8），10%SDS，10%APS，TEMED，DDW，30%丙烯酰胺（30% Acrylamide/Bis solution），PBS-T缓冲液，丽春红染色液，70%乙醇。
实验前准备：1、清洗制胶用玻璃板和卡槽，晾干备用。
2、蛋白样品加入巯基乙醇和Loading Buffer并在干式恒温加热器上95°C变性3~5min。
3、剪取适当大小的硝酸纤维素膜，放在4°C 转膜缓冲液中活化5min。
4、将滤纸和海绵垫浸泡在转膜缓冲液中湿润。
实验步骤一、灌胶1、将清洗干净并已晾干的玻璃板插入到制胶卡槽内，使底端平整，高的一面朝内，以便固定。
2、按照10%分离胶的配制，按体积大小依次加入到50ml tube中混匀，10%APS和TEMED最后加入，此二者为催化剂。
10%分离胶配制如下：（一块胶）9ml30% Acrylamide/Bis 2.97ml1.5M Tris-HCL PH=8.82.25ml10% SDS 90ulDDW 3.6mlTEMED 4ul10% APS 90ulTotal Volume 9ml3、将混匀的分离胶沿着玻璃板边缘加入，液面高度不超过夹板下缘（大约7.5~8ml），以低于下缘2~3mm为宜，然后在液面加入70%乙醇溶液封液面，液面高度与夹板顶端齐平，等待15~20min。
4、期间配制4%浓缩胶，配法与步骤2一样，按体积大小依次加入，催化剂TEMED和10%APS最后加入：等分离胶已经凝固好要灌浓缩胶的时候加入。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
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Western blot基础知识一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类根据凝胶电泳的类型，WB可分为：*还原（变性）WB：最常用的一类，使用SDS-PAGE电泳。
主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等*非还原（非变性）WB：主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。
一般不使用SDS、DTT等变性剂。
western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲叉双丙稀酰胺1g温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水至100ml终体积储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS 0.1g去离子水1ml室温保存。
3、分离胶缓冲液1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)Tris base 18.15g1mol/LHCL 48mlSW 至100ml终体积过滤后4℃保存。
4、浓缩胶缓冲液0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8)Tris base 6.05gSW 40ml用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
10%(w/v)过硫酸胺溶液。
提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油 6.4ml10%SDS 12.8ml巯基乙醇 3.2ml0.05%溴酚蓝 1.6mlH2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸188gSDS 10gSW 至1000ml得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液甘氨酸 2.9gTris碱 5.8gSDS 0.37g甲醇200mlSW 至总量1L9、丽春红染液储存液丽春红S 2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30gSW 至100ml加水用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。
使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、100mmol/L NaCl。
19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
四、实验流程第1步：组织或细胞蛋白提取蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！收集106细胞，加入150μl SDS裂解液，冰上超声5次，定量。
第2步：电泳、转膜电泳和转膜是保证成功进行WB后续检测的前提条件。
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。
常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。
在电泳和转移过程中，正确使用蛋白质分子量Marker，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证！SDS-PSGE电泳：1.准备各溶液。
小烧杯两个，5ml枪头6个，吸水纸，罐胶电泳设备。
2.准备罐胶槽。
将玻璃板擦干净，放入短架子内，薄板靠门，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面（否则漏胶）；将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜；将短架子装在长架子上（短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶）。
3.准备配胶。
将各溶液（ddH2O，单体，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次摆好，5ml 枪头插于长罐胶槽，调好取TEMED、APS的枪。
4.配分离胶。
在一小烧杯上装半杯ddH2O；另一小烧杯依次加上述各液（加TEMED、APS时要迅速），快速摇匀。
注：胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。
5.罐胶。
从玻璃板中间注入胶液，注胶速度均匀，不要产生气泡。
罐胶后用ddH2O 压胶。
6.等待时：将Tris-HCl换成pH6.8。
换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。
调好各移液器。
7.30分钟后。
倒掉压胶水，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。
8.配集成胶。
参见步骤4。
9.罐胶。
参见步骤5，灌满为止，不要有气泡。
10.插梳。
梳柱下面不要有气泡。
11.等待时。
A：配电泳缓冲液。
B：将样本煮沸5分钟。
C：水中冷却，短暂离心后依加样序排放好。
D：等胶近凝时，将玻璃板装在电泳架子上，罐内槽液于槽中，检查是否密封。
E：将上槽架子按于槽中。
12.30分钟后。
罐上槽液超过短玻璃板，拔梳（注意力道适中，不能太快）。
放置上样架子。
13.上样30μl。
枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，枪头随液面上涨而上提。
可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品都须同样处理。
14.加外槽液。
15.电泳。
转膜：1.准备。
分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具，在电泳槽中倒好转膜液2.揭胶。
电泳结束后，将电泳槽移至水池中，倒掉电泳液，将内槽提起放在水池边，取出两边玻璃板。
用纯水冲干净玻璃板，小心揭开短板，去掉集成胶，小心将胶转入转膜液在中。
3.转膜。
将夹子打开，黑色在底，依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵，关好夹子（均在液面下进行，注意气泡）快速放入架子中。
在电泳槽中放冰袋。
4.电泳。
蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。
浸泡在转膜缓冲液中5分钟左右，以平衡离子强度。
视情况决定是否切角标记。
2）电用结束前，应泡好3M滤纸2-6张均可（普通滤纸也可）和1张硝酸纤维素滤膜。
3）戴上手套按如下顺序安装转移装置：a.平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。
b.在海绵垫片上放置1-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。
c.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。
排除所有气泡。
d.把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。
e. 把最后1-3张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方，同样须确保不留气泡。
其实，用玻棒给点压力很容易排除气泡。
f.放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。
保证对凝胶有一定的压力。
4）连接电源。
电转过程中，尽量给个低温环境，我放在冰水里转膜，也用内置的冰盒。
5）断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。
将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否完全。
要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色3-10分钟，然后蒸馏水冲洗6）切去滤膜的左下角，以标记，如有预染MARKER也可不标。
7）杂交与显色：①封闭②一抗孵育：分别与相应的抗体及内参照抗体孵育③漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各10min。
④与二抗孵育：与辣根过化物酶标记的二抗孵育⑤漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗4次以上，每次各10min。
⑥ECL显像⑦显影定影完毕第3步：加入一抗孵育一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：1、选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）2、选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）3、选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体一抗的保存和使用：1、根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。
2、抗体的工作液最好现配现用，在4度保存最好不要超过2周3、由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。
1.转膜等待时准备封闭液（即Non-fat milk 5% in TBST）。
2.转膜完毕后，将膜放入封闭液中，轻摇孵育1小时。
3.孵一抗。
将封闭好的膜在转移到一抗盒子中，室温孵育两小时或4℃过夜，4.洗涤将孵育好一抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
5.孵二抗。
将洗好的膜放在二抗中室温孵育两小时。
6.洗涤。
将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
7.ECL化学发光和曝光显影。
实验常见的问题指南1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz 的一抗仍不行。