双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用
蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术
进行二 次 电泳 的过程 ． 首先在 第 一 向电泳 中根 据
蛋 白质所 带 电荷 的性质 进 行 等点 聚 焦 （Ｅ ） 等 ＩＦ ，
２ 双 向 电泳 的 主 要技 术 步 骤
２ １ 样 品制备 ．
点聚焦 时 由于各 种蛋 白等 电点 的不 同 ， 高 电压 在 场 的作用 下 ， 白质 在 ｐ 梯 度 胶 中移 动 ， 到 蛋 Ｈ 直
３ 攀 枝 花市 食 品与 药 品 监督 管 理 局 ，四 川 攀 枝 花 ．
［ 摘
要 ］ 当今 生命科 学研 究的热 门领域 蛋 白质 组 学研 究 中 ， 向电泳技 术是 分 离检 测 细胞 、 在 双
细胞 系、 器官和组织的 总蛋 白质组 的最有 效的方法． 双向 电泳技术是根据蛋 白质等 电点和分子 量 两个相互独立 的参数 ， 在相互垂直 的两个方 向进行 二 次 电泳 的过 程 ， 主要 步骤 包括 样品 制备 、 其
质． 目前 ＩＧ—Ｄ Ｌ Ｐ Ａ Ｔ已 经取 代 其 他 两 者 成 为 等
点聚焦 的主要 手段 ． 的优势 在 于 ：Ｈ 梯度 稳 它 ｐ
定， 聚焦 准确 ， 度高 ； 阴极 漂移 及碱 性 蛋 白丢 精 无 失的现象 ； 白上 样 量 大 ， 以提 高低 丰 度 成分 蛋 可
蛋 白几乎是 不 可 能 的． 根据 实验 要 求 的 不 同 ， 可 按各 种属性 将蛋 白分别 提取 ， 比如 Ｍｏ ｏ ｌｙ等 用 ｌ ３种 分别 适 合 溶 解 高 、 、 亲 水 性 蛋 白质 的裂 中 低
［ 收稿 日期 ］０ ０— ８—１ ２１ ０ ５
的提取 ， 可在样 ຫໍສະໝຸດ 中加入蛋 白酶抑制 剂 以 防蛋 白
质 水解 ， 在样 本 处理 中尽 量 富集 低 丰度 蛋 白 ， 并 采用 灵 敏度较 高 的银 染或荧 光染 色．
2D-DIGE技术在蛋白质组学中的应用
下 ， 物 细胞 中蛋 白质 表 达 的 差 异 性 ， 而建 立 差 异 蛋 白相 互 作 用 网 络 图 ， 而 为研 究伤 害机 制 提 供 一 定 的依 据 。 植 从 从 关 键 词 ：Ｄ Ｄ Ｇ ； 白质 组 ２ －ＩＥ 蛋
中图分 类号 ：５ Ｑ１
文献标识码 ： Ｂ
文章编号 ：０ ５—１３ （０ １ ｏ — ０４— ４ ２９ ７６ ２ １ ） ３ ０ ８ ０
２Ｄ－ ＧＥ ｎ ｐ ｏ ｅ ｍ ｉ ｓ ａ ｐ ｉ ａ ｉ ｎｓ ＤＩ ｉ ｒ ｔ ｏ ｃ ｐ ｌ ｔｏ ｃ
ＤＵ Ｊ ｎ ｂａ ｕ — ｉｎ ，Ｗ ＡＮＧ Ｌ — ｕ ｉ ｉ，ＤＵ ｈ ＡＮ ｉｎ —ａ Ｊａ ｇｙ ｎ
（ ．ｃ ｏｌ ｆ ｉ ｃ ｎｅ Ｓ ａＸ ｏ ａ Ｕ ｉ ｒｔ， ｉ ｅ ４ ０ ０ ２ ｅａ ｍ ｎ ｏ ｔ ｉ ｓ １ Ｓｈｏ ｏ ｆ Ｓ ｉ ｃ ， ｈｎ ｉ ｒ ｌ ｎ ｅ ｉ Ｌｎ ｎ ０ ； ．Ｄ ｐｒ ｅｔ ｆ ｅ ａ Ｌｅ ｅ Ｎ ｍ ｖ ｓｙ ｆ ０１ ｔ Ｍａ ｒ ｌ
从生物体 的不 同器官 ， 组织 ， 细胞 以及亚细胞结 构
中将 成 千 上 万 种 蛋 白质进 行 提 取 和分 离 是 蛋 白 质组 学
这 ～ 方 法 应 用 到 蛋 白质 组 学 研 究 领 域 ，在 双 向凝 胶 电 泳 的基 础 上 又 形 成 了 一 项 新 技 术 — — 差 异 凝 胶 电 泳 （ ｉｅ ｎｅｇｌ ｌ ｔ ｐ ｏ ｓ ，ＤＧ ） Ｄｆ ｒ ｃ ｅ ｅ ｃ ｏｈｒ ｉ Ｉ Ｅ ，即 将 样 品 在 双 ｆｅ ｅ ｒ ｅｓ
双向电泳技术的原理及应用
双向电泳技术的原理及应用1. 原理双向电泳技术是一种分离和鉴定蛋白质的常用方法。
它结合了凝胶电泳和电泳移动的优势，可以在同一实验中实现更高的分辨率和更好的分离效果。
双向电泳的原理基于两个关键因素：分子大小和电荷。
在实验中，蛋白质样品首先沿一个方向进行电泳。
由于蛋白质的不同大小和电荷，它们会在凝胶中形成不同的带状图案。
然后，凝胶会旋转90度，使蛋白质在垂直方向上进行电泳。
这样一来，蛋白质会在另一个方向上发生分离。
双向电泳的核心是双向凝胶，其结构类似于二维网络。
在第一个方向上，凝胶中的蛋白质会形成一维图案，而在第二个方向上，蛋白质会形成另一维图案。
通过对这两个图案的分析，可以得到更为准确的蛋白质信息。
2. 应用2.1 蛋白质分离和纯化双向电泳技术在蛋白质分离和纯化中有着广泛的应用。
由于双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。
这在研究蛋白质结构和功能以及疾病诊断中具有重要意义。
2.2 蛋白质组学研究双向电泳技术在蛋白质组学研究中发挥着重要作用。
通过双向电泳，可以分离出复杂样品中的蛋白质，并获得其质量和电荷信息。
这些信息可以用于鉴定蛋白质和研究其功能。
2.3 药物研发双向电泳技术在药物研发中也有广泛的应用。
通过双向电泳，可以分离和鉴定药物的靶点，进一步了解药物与蛋白质的相互作用机制。
这对于药物设计和优化具有重要意义。
2.4 分子生物学研究双向电泳技术在分子生物学研究中有着重要的应用。
通过双向电泳，可以鉴定蛋白质的表达变化，从而了解基因表达调控机制。
这对于研究细胞功能和疾病发生机制具有重要意义。
2.5 环境监测双向电泳技术在环境监测中也有着广泛的应用。
通过双向电泳，可以分离和鉴定环境中的污染物，从而评估环境质量和污染程度。
这对于环境保护和治理具有重要意义。
3. 优缺点3.1 优点•分辨率高：双向电泳可以提供更高的分辨率，可以分离和鉴定更多的蛋白质。
•信息丰富：双向电泳可以获得蛋白质的质量和电荷信息，有助于了解蛋白质的结构和功能。
荧光差异显示双向电泳技术原理
荧光差异显示双向电泳技术原理双向电泳是一种常用的蛋白质分离技术，通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。
而荧光差异显示双向电泳技术则是在双向电泳的基础上，利用荧光染料对蛋白质进行标记，使得分离出的蛋白质带状区域能够以荧光的形式显示出来。
本文将详细介绍荧光差异显示双向电泳技术的原理及其在蛋白质研究中的应用。
荧光差异显示双向电泳技术的原理主要包括样品制备、电泳分离、荧光染色和荧光成像等步骤。
样品制备是荧光差异显示双向电泳的关键步骤之一。
样品制备的目的是将蛋白质从复杂的生物体中提取出来，并使其具备较好的电泳性质。
常见的样品制备方法包括胶束电泳法和硅胶柱层析法等。
胶束电泳法是通过洗涤剂将蛋白质从细胞中溶解出来，形成胶束溶液，再经过离心等步骤得到纯化的蛋白质样品。
硅胶柱层析法则是利用硅胶柱将蛋白质样品分离纯化，去除杂质。
样品制备的关键在于保证蛋白质样品的纯度和完整性，以便后续的电泳分离。
电泳分离是荧光差异显示双向电泳的核心步骤。
电泳分离是通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。
由于蛋白质的分子量和电荷差异，蛋白质在电场中会产生不同的迁移速度，从而实现分离。
双向电泳是指在水平方向和垂直方向施加交叉电场，使得蛋白质样品能够同时在两个方向上进行迁移，从而增加了分离效果。
电泳分离的关键在于电场的施加和控制，以及电泳胶的选择和制备。
然后，荧光染色是荧光差异显示双向电泳的重要步骤之一。
荧光染色是通过将蛋白质样品与荧光染料结合，使得分离出的蛋白质能够以荧光的形式显示出来。
常用的荧光染料包括SYPRO Ruby、CyDye和FluorProtein等。
荧光染色的关键在于染料的选择和染色条件的优化，以确保荧光信号的强度和稳定性。
荧光成像是荧光差异显示双向电泳的最后一步。
荧光成像是通过荧光成像仪将荧光信号转化为图像，以便后续的分析和解读。
荧光成像的关键在于成像仪的选择和参数设置，以及荧光信号的采集和处理。
荧光差异显示双向电泳技术在蛋白质研究中具有广泛的应用。
双向电泳技术原理及其应用
¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。
关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库;减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)022*******随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。
双向电泳(tw o 2dimensional electrophoresis,22D E)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。
1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH 梯度胶中等电聚焦(isoelec tric f ocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAG E)第二次分离。
根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE 分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为IS O 2D A L T 。
其主要缺点是pH 梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines 共聚,形成具有pH 梯度的凝胶,这种系统称为IPG 2D AL T 系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO 2D AL T 的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于I SO 2D AL T;第三种是非平衡pH 梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis,NEPhG E),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。
双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用
双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用摘要从双向电泳的历史、原理、操作步骤及其在植物蛋白质组学研究中的应用等几方面进行综合阐述，最后提出双向电泳技术中存在的一些问题，并展望了其在植物蛋白质组学研究中的未来应用前景。
关键词蛋白质组学；双向电泳技术；植物研究表明遗传信息通过基因携带，但基因结构的相对稳定性、数量的有限性，与生命现象的多变性、复杂性存在明显的差异[1]。
为此，研究认为在所有生物体的细胞、组织、细胞器中，各种代谢反应、生理功能的维持均由各组成部分的表面、内部的蛋白质来完成。
蛋白质组是Wilkin S等在1994年第1次提出的。
1997年蛋白质组的定义被其创造者重申为：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质。
”2000年人类基因组序列草图的完成标志着“后基因组时代”的到来。
蛋白质组学（proteomics）的概念最终被定义为“一个基因组、或一个细胞、组织在特定的生理和病理条件下表达的所有蛋白质”。
蛋白质组具有特殊性和多样性，其研究的三大核心技术分别是双向电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、生物质谱技术和生物信息学[2-3]。
其中，2-DE作为蛋白质分离的重要手段，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离上万个蛋白质的方法，且分离纯度可达90%以上。
1 双向电泳技术的历史双向电泳技术自诞生以来，一直在不断的发展、改进。
1975年O`Farrell对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究中首次采用了双向电泳技术，称为ISO-DALT（等电点-道尔顿）。
其第一向是将载体两性电解质（CA）添加到丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的pH梯度进行等电聚焦；第二向是聚焦后的凝胶在含有SDS的缓冲液中平衡后，用琼脂糖包埋到垂直板SDS 凝胶的浓缩胶上，形成不连续的SDS梯度凝胶电泳[4]。
这种双向电泳蛋白质由于上样量低，溶解性较差，可能会造成负性部分碱性蛋白丢失。
双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用(1)
❖2 蛋白分离：双向电泳（2-D），液相 色谱等
❖3 蛋白质鉴定：质谱技术
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双向电泳 —质谱
LC-MS-MS
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双向电泳技术
❖1975年意大利生化学家O'Farrel等于发明 了双向电泳技术
❖该技术一度成为蛋白质组学研究的一把利 器，经典的蛋白质组学研究技术之一。
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双向电泳基本原理
❖根据蛋白质等电点与分子量的不同，在 横向与纵向对蛋白进行分离
❖首先，一向电泳时由于蛋白质的等电点 不同，蛋白质运动到胶条不同的位置
❖然后，二向电泳时位于胶条上蛋白又由 于分子量的不同被分离，最终在一张 PAGE胶上显示出来蛋白点
❖这些蛋白点代表了不同的等电点和分子 量，最后通过质谱技术鉴定蛋白
DNA
RNA
Protein
❖蛋白质是生命现象的体现者
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蛋白质组学的来源
❖1994年澳大利亚的两位学者Wilkins和 Williams首先提出了蛋白质组(proteome) 的概念：
❖基因组所表达的全部蛋白质，是细胞或组 织或机体在特定时间和空间上表达的所有 蛋白质
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蛋白质组学的技术流程
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双向电泳技术流程（全）
样品制备
染色
一向电泳
扫描
平衡
分析
二向电泳
Hale Waihona Puke 挖点，质谱10整理ppt
双向电泳技术流程
❖样品制备方法： ❖ 研磨 ❖ 冻融 ❖ 超声破碎 ❖ 离心 ❖原则：蛋白质可溶，不含DNA、不含
蛋白质组学研究介绍结合双向电泳
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质表达分析
研究不同生理或病理条件下蛋白质的表 达水平变化，揭示蛋白质的表达模式和
规律。
蛋白质相互作用研究
利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术 手段，研究蛋白质之的相互作用和
复合物的形成。
蛋白质功能研究
通过基因敲除、基因敲减、定点突变 等技术手段，研究蛋白质的功能和作 用机制。
智能化
结合人工智能和机器学习技术，实现双向电 泳的智能化分析，自动识别和鉴定蛋白质， 提高数据分析的准确性和可靠性。
拓展双向电泳技术的应用领域
临床诊断
01
将双向电泳技术应用于临床诊断，通过对生物标志物的检测和
分析，辅助医生进行疾病诊断和治疗方案的制定。
药物研发
02
利用双向电泳技术筛选和鉴定药物作用靶点，为新药研发提供
蛋白质芯片技术
高通量、快速、简便，但灵敏度和分辨率相对较低，且覆盖的蛋白质数量有限。
双向电泳与蛋白质免疫印迹技术的比较
双向电泳
可以对全蛋白质组进行分离和定性，分 辨率高。
VS
蛋白质免疫印迹技术
可以对特定蛋白质进行检测和定量，灵敏 度高，但只能针对已知的蛋白质进行检测 。
05
双向电泳技术的发展前景 和展望
蛋白质的纯化
通过双向电泳，可以去除样品中的杂 质，提高蛋白质的纯度，从而获得更 准确的鉴定结果。
蛋白质的表达和鉴定
蛋白质表达分析
通过比较不同生理状态或不同组织中 蛋白质的表达模式，可以研究蛋白质 的表达水平，进而了解其在生命活动 中的作用。
蛋白质鉴定
通过与已知蛋白质的数据库进行比对， 可以鉴定出双向电泳图谱中的蛋白质， 为后续的功能研究提供依据。
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张科 动物科技学院 2014年7月
Outline
1 2 3 4 蛋白质组学简介 双向电泳原理和技术流程 双向电泳技术的衍生 双向电泳技术的应用
20世纪人类自然科学史上的三个伟 大计划
人类基因组计划
阿波罗登月计划
曼哈顿原子弹计划
人类基因组测序，植物、动物、微生物等物种 的测序并没有带来一劳永逸的健康，粮食、卫 生等存在问题
双向电泳技术流程（全）
样品制备
染色
一向电泳 扫描
平衡
分析 二向电泳
挖点，质谱
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双向电泳技术流程
样品制备方法： 研磨 冻融 超声破碎 离心 原则：蛋白质可溶，不含DNA挖点， 质谱测序
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3 蛋白质鉴定：质谱技术
双向电泳 —质谱
LC-MS-MS
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双向电泳技术
1975年意大利生化学家O'Farrel等于发明 了双向电泳技术 该技术一度成为蛋白质组学研究的一把利 器，经典的蛋白质组学研究技术之一。
双向电泳基本原理
根据蛋白质等电点与分子量的不同，在 横向与纵向对蛋白进行分离 首先，一向电泳时由于蛋白质的等电点 不同，蛋白质运动到胶条不同的位置 然后，二向电泳时位于胶条上蛋白又由 于分子量的不同被分离，最终在一张 PAGE胶上显示出来蛋白点 这些蛋白点代表了不同的等电点和分子 量，最后通过质谱技术鉴定蛋白
DNA
Protein
RNA
蛋白质是生命现象的体现者
蛋白质组学的来源
1994年澳大利亚的两位学者Wilkins和 Williams首先提出了蛋白质组(proteome) 的概念： 基因组所表达的全部蛋白质，是细胞或组 织或机体在特定时间和空间上表达的所有 蛋白质
蛋白质组学的技术流程
1 样品制备（最关键）：显微切割， 细胞培养，超声破碎，裂解程序 2 蛋白分离：双向电泳（2-D），液相 色谱等
……….
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双向电泳的技术的衍生
差异蛋白质组学 免疫蛋白质组学（筛选免疫原性蛋白 等） 亚细胞蛋白质组学（线粒体，溶酶体， 外膜蛋白等） 定量蛋白质组学（DIGE）
双向电泳技术的应用
疾病蛋白质组学（健康组，疾病组， 用药组） 研究对象：含蛋白，毛发、骨髓，组 织、细胞等 血清蛋白质组学（筛选biomarker）