致病基因的定位与克隆(上)
基因工程(李立家)小题目及答案
基因工程试题及答案1.标记（探针）（已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。
带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。
使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。
1）切口平移标记: 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH 末端（这条链即成为引物）。
DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)2）随机引物标记: 能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。
DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。
3) PCR标记: 针对目的片段，设计好引物，以标记号的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针4）末端核苷酸转移法:P32和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA。
先用碱性磷酸酶处理去除DNA 5’的磷酸基团，多核苷酸激酶用于对缺乏5'-磷酸的DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。
补充：1）常用的标记物包括：P32的同位素标记；荧光探针标记的dNTP；生物素；地高辛2）应用：定性（是否转入该基因）；定量（含量的高低）；定位；成分（配对的程度、是否同源）2.PCR技术（试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。
）（1）PCR的概念：又称为聚合酶链反应,能在体外特异快速扩增DNA片段。
组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）（2）PCR技术的原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
名词解释-分子生物学
1、转录（Transcription）：以某一DNA链为模板，按照碱基互补原则形成一条新的RNA链的过程，是基因表达的第一步。
2、编码链：与mRNA 有相同序列的DNA 链3、下游：沿着表达方向的序列。
例如，编码区是在起始区的下游。
4、上游：转录起点之前的序列，例如，细菌启动子在转录单位的上游，起始密码在编码区上游。
5、启动子：结合RNA 聚合酶并起始转录的DNA 区域。
6、RNA聚合酶：使用DNA作为模板合成RNA的酶(正式应为DNA-依赖性RNA 聚合酶)7、终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。
DNA分子中终止转录的核苷酸序列。
8、转录单位：指RNA聚合酶起始位点和终止位点间的距离，可能包括不止一个基因。
9、初级转录本：与一个转录单位相对应的未修饰的RNA 产物。
10、组成型表达constitutive expression：个体发育的任一阶段，在所有细胞中都持续进行的表达。
一般是生命过程必需的基因。
11、负调控：在没有任何调节蛋白或其失活的情况下，基因表达；存在repressor的时候基因表达受阻。
12、正调控：在没有任何调节蛋白或其失活的情况下，基因关闭；存在activator的时候基因表达开启。
一般原核生物偏向负调控，原核生物的DNA裸露无保护，很容易启动转录，并翻译。
因此其细胞内的基因可以说是基本全部默认开启，因此在正常情况下原核细胞内存在大量不同的reressor阻遏着大量基因的转录。
细胞必须根据不同的条件，对一些被阻遏的基因进行去阻遏的调控，或对一些基因的表达进行阻止。
13、顺式作用元件cis-acting element DNA分子上的一些与基因转录调控相关的特定序列。
14、反式作用因子trans-acting factor一些与基因表达调控有关的蛋白因子。
15、顺式调控cis-acting regulation 一段非编码DNA序列对基因转录的调控作用，顺式正调控（启动子、增强子）；顺式负调控（沉默子）16、反式调控trans-acting regulation 转录因子作用于顺式作用元件对基因转录的调控。
图位基因克隆
图位基因克隆在生命科学的广袤领域中，图位基因克隆技术宛如一颗璀璨的明星，为我们揭示基因的奥秘、理解生命的密码提供了强大的工具。
它是一项复杂而精妙的技术，涉及众多学科的知识和技术手段，让我们一同走进这个神奇的世界，探寻图位基因克隆的奥秘。
要理解图位基因克隆，首先得明白基因在染色体上的位置并非随机分布，而是有着特定的规律和秩序。
而图位基因克隆就是基于这种位置信息来定位和分离目标基因的方法。
想象一下，染色体就像是一条长长的道路，基因则是这条道路上的一个个站点。
我们要找到特定的那个“站点”——目标基因，就需要有一张详细准确的“地图”。
这张“地图”就是遗传图谱和物理图谱。
遗传图谱是通过分析不同基因之间的遗传连锁关系构建而成，它就像是给我们指明了各个“站点”之间的相对距离和大致方向。
物理图谱则更加精确，它能告诉我们基因在染色体上的具体位置和实际距离。
有了这两张“地图”，我们就可以开始寻找目标基因的征程了。
首先，我们需要找到与目标基因紧密连锁的分子标记。
这些分子标记就像是道路上的路标，能帮助我们逐渐靠近目标基因。
通过对大量的个体进行基因分析和遗传标记检测，我们可以确定这些标记与目标基因之间的距离和位置关系。
接下来，就是通过染色体步移或者染色体跳跃等技术，逐步缩小目标基因所在的区域。
这就好比我们沿着道路一步步前进，不断接近我们的目的地。
在这个过程中，需要进行大量的实验和数据分析，每一步都需要严谨细致，容不得半点马虎。
当目标基因所在的区域被缩小到一定程度后，就可以利用基因文库筛选或者 DNA 测序等技术来确定目标基因的具体序列。
基因文库就像是一个装满了基因片段的宝库，我们要在其中找到我们所需要的那一片“拼图”。
而 DNA 测序则能让我们直接读取基因的“密码”，最终确定目标基因的身份。
图位基因克隆技术在农业、医学等领域都有着广泛的应用。
在农业方面，它可以帮助我们培育出更加优良的作物品种。
比如，通过克隆与抗病虫害相关的基因，我们可以让农作物拥有更强的抵御病虫害的能力，从而减少农药的使用，提高农产品的产量和质量。
医学遗传名词解释
染色质（chromatin）是由DNA、RNA、蛋白质等组成的复合物，是核基因的载体，在真核细胞间期呈伸展状态。
染色体（chromosome ）细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质凝缩而成的棒状结构。
常染色质(euchromatin)：细胞间期核内纤维折叠盘曲程度小，分散度大，染色较浅且具有转录活性的染色质。
异染色质(heterochromatin)：细胞间期核内纤维折叠盘曲紧密，呈凝集状态，染色较深且很少有转录活性的染色质。
由于雌性细胞中的两条X染色体中的一条发生异固缩，失去转录活性，这保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上，这种效应称为X染色体的剂量补偿(dosage compensation)。
基因(Gene）：遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位；负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。
微卫星DNA（Microsatellite）、STR（Short Tandem Repeat）、DNA指纹是由2—6bp重复单位构成核心序列，也称短串联重复序列(STR)，是一种广泛分布在人类基因组中的DNA片段，主要由核心序列拷贝数目的变化产生长度多态性，其在人群中存在个体间的高度变化，是DNA指纹的形成基础。
指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性,在群体中的发生频率不小于1 %，就称为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）。
外显子（exon）内含子（intron）突变(mutation)：遗传物质所发生的可被检测和可遗传的改变；通常对机体有害。
广义：包括染色体和DNA的改变；狭义：指基因组DNA分子的碱基组成或其顺序的改变。
转换（transition）颠换（transversion）错义突变（missense mutation）同义突变（same sense mutation）无义突变（nonsense mutation）动态突变（Dynamic Mutation）人类基因组中的短串联重复序列，尤其是基因编码区或侧翼序列的三核苷酸重复，在一代代传递过程中重复次数发生明显增加，从而导致基因功能改变而产生疾病。
基因定位常用的方法
HAT选择系统： HAT选择系统： 选择系统
人的突变细胞株：缺乏HGPRT 人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK TK酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT HAT培养基中 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： HAT培养基： 培养基 为次黄嘌呤， HGPRT的底物 的底物， DNA合成提 H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提 供原料（核苷酸旁路合成原料） 供原料（核苷酸旁路合成原料） 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP DNA合成 TMP合成受抑 A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑 制） 在胸苷激酶（TK） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核 苷酸， DNA合成提供原料 苷酸，为DNA合成提供原料
1）概念： 概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染 色体上呈直线排列， 色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成 连锁群的原理， 连锁群的原理，即应用被定位的基因与同 一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的 特点进行定位。 特点进行定位。
19
2）重组值（recombination fraction） fraction） 重组值（ 是基因定位时两个基因间遗传图距的量 即基因间的遗传距离。 度，即基因间的遗传距离。如果两个基因 间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 1%的重组值 间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 centimorgan，cM） （centimorgan，cM） 遗传标记（ marker） 3）遗传标记（genetic marker） 用连锁分析发法进行基因定位需要已知 的记忆内作为遗传标记， 的记忆内作为遗传标记，这些标记按孟德 尔方式遗传，标记位点应是多态的。 尔方式遗传，标记位点应是多态的。
基因定位常用的方法
定位克隆鉴定的第一批基因利用了特定基因座的染色体畸变，Duchenne肌营养不良(DMD)基因的克隆是一个重要的例子。
假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)
由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病,发病率为1/3500，XR遗传。 主要症状:通常3---5岁发病,开始走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难,Gower征阳性.进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大,10多岁下肢瘫,一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.
3）原位杂交的特点： 杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。
因此在HAT培养基上
人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍）
鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）
将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。
基因定位与克隆
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
体细胞杂交
TK: chromosome 17
杂种细胞克隆嵌板
Hybrid clone A B C Human chromosome 1 + + + 2 + + 3 + + 4 + 5 + + 6 + 7 + 8 -
体细胞杂交
微细胞融合( 微细胞融合(microcell fusion)
人工建立的仅含有一条人类染色体 的杂种细胞， 微细胞， 的杂种细胞 ， 即 微细胞 ， 再与啮齿类细 胞进行融合。 胞进行融合。
体细胞杂交
区域定位(regional 区域定位(regional assignment)
依据染色体结构畸变的特点， 依据染色体结构畸变的特点 ， 建立 只含有特殊的部分人类染色体的杂种细 胞，再与啮齿类细胞进行融合。 再与啮齿类细胞进行融合。
定位克隆
Met A A Met Val Ser Leu Gln Pro
T G G T C T C A C T G C A A C C G
T G G Val T C T Ser C A C Leu T G T Stop A A C C G
候选克隆
候选克隆(candidate cloning)是一种 候选克隆 是 用定位和非定位的信息相结合来克隆致病 基因，即根据一些基因的位置、表达、功 基因，即根据一些基因的位置、表达、 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。
候选克隆
定位候选克隆
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
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DMD基因的克隆
• X染色体隐性遗传
– 多为男性患者 – 家系隔代传递
• 女性患者（X-常染色体平衡易位）
一项对若干女性DMD患者的细胞遗传学研究发现： 每个病例受累的常染色体不同， 但在X染色体上的断裂点总是Xp21。
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X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果
如果发生易位的X失活， 所以所有存活细胞 中失活的都是完整 则相当于有一条常染 色体也失活——致死。 的X染色体。
6
遗传标记
• 可用于鉴别细胞、个体或物种的一段DNA 序列，其在染色体上的位置为已知。 • 在群体中等位基因频率大体相当，可以被 普遍检出的变异(variation)。 • 包括：
– 碱基的变化（RFLP, SNP） – 一段序列重复数（STR, VNTR, CNV）
7
遗传标记——STR
3 2 1
疾病
性状 （疾病）
功能
蛋白质产 物（生物 学功能）
染色体定 位
列
16
功能克隆
• 绝大部分分子病、遗传代谢病（生化代谢 酶缺陷）都是采取的这一策略。
– 白化病（albinism） – 苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU） – 镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease） – ……
聚丙烯酰胺凝胶电泳区分STR标记的等位片段
1： (CA)19 2： (CA)25 3： (CA)278源自遗传标记——SNP9
基因定位的层次
• 确定某个（某一系列）表型相关的基因所 在染色体上的位置
– 染色体 – 染色体区带 – 遗传图 – 物理图
10
基因定位的发展
1911
•Wilson, 红绿色盲基因定位于X染色体上 •人类基因定位的先河 •Donahue, Duffy血型基因定位于1 号染色体上 •首次在常染色体上进行的基因定位 • 体细胞杂交、重组DNA、分子杂交和PCR等技术 • 基因定位的速度、数量明显加快
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进行性肌营养不良症(DMD/BMD)
• 抗肌萎缩蛋白(dystrophin)遗传性缺陷所致的进行性 肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病
–发病率为1/3500 –XR遗传。
• 主要症状:
• 3---5岁发病 • 走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难 • Gower征阳性 • 进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大 • 10多岁下肢瘫 • 一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.
1968
1970~1990s
2000~
• 人类基因组计划的实施和完成 • 基因组水平 • 芯片技术、第二代测序技术的商用 • 全基因组水平
11
2005~
基因定位路线图
疾病 定位 功能
基因
12
基因克隆与定位技术路线
疾病 定位 功能 定位 基因 疾病 功能
基因
功能克隆
定位克隆
13
功能克隆和定位克隆的比较:
疾病
遗传标记， 染色体定位
•
•
基因 序列
基因
mRNA cDNA 蛋白质产物 生物学功能
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功能
定位克隆
• 功能克隆——基因表达产物
• 定位克隆——染色体/基因组特征与表型的 关联性
染色体/基因组特征 染色体畸变
遗传标记——统计学分析
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利用染色体畸变进行定位克隆
最早利用定位克隆方法鉴定的基因主要 是借助于特定基因座的染色体畸变，DMD基 因的克隆是一个重要的例子。
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功能克隆的技术路线
蛋白质 mRNA/cDNA 基因组/染色体
1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序 列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA 或 基因组中筛选对应的编码基因。
蛋白质抗体表达筛选2. 将异常蛋白质制成相应的DNA序 列分析确定导致疾病的分子缺陷。
18
功能克隆举例
• β珠蛋白基因的克隆
• 凝血因子VIII基因的克隆
19
β珠蛋白基因的克隆
• mRNA
• cDNA
已知
放射性标记
• 基因组
Southern 印记 原位杂交
20
凝血因子VIII基因的克隆
• • • • mRNA 部分蛋白序列 寡核苷酸探针 人基因组未知 已知 推测 拼接 筛选
3、复等位基因（multiple alleles）：在一个群体 中，一个特定的基因座上，可以有很多等位形式， 如 a1 、a2 、a3… an ，但对于每个人来说， 最多只能具有其中的两个。
5
基本概念
4、基因型（genotype）:是一个个体的遗传组成。一 般指一个特定的基因座上的等位基因。 5、表型（phenotype）：基因型和环境因素相互作 用所表达的、能够显示出的遗传性状。
① 通过女性患者X-常染色体易位，克 隆了该基因的一部分。 ② 使用有Xp21.1微小缺失的男孩的DNA， 利用消减技术，获得了这个男孩X染色体中 缺乏的DNA片段。
30
• 类似的策略：
– 粘多糖贮积症IVA型——GALNS基因
• AR，散发病例 • 一例新生突变患者，染色体缺失
31
遗传标记与连锁分析
放射性标记
Shouthern 印记 原位杂交
21
• mRNA • cDNA • 基因组
定位克隆
22
定位克隆
疾病
• 旧称为“逆向遗传学”，始 于20世纪80年代后期 利用遗传连锁或细胞遗传学 定位技术将致病基因定位于 染色体的特定区带。 定位：通过连锁分析找出与 目的基因紧密连锁的遗传标 记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段 内分离克隆所要的基因，并 进一步研究其功能。 •
在传统的功能克隆中,基因功能的研究 先于基因鉴定和定位。
在定位克隆中,基因定位在先,随后再 鉴定基因。基因已鉴定后,可以进行基 因功能的选择性研究。
14
功能克隆
15
功能克隆
• 从异常表型入手， 找出造成表型的基 因表达产物，比如 与代谢缺陷相关的 失活或缺失的酶， 异常的结构蛋白质 分子或mRNA等， 通过各种方法确定 基因，最后将相应 的基因定位。
1931, from Ger. allel, abbrev. of allelomorph (1902), coined from Gk. allel- "one another" (from allos "other;" see alias) + morphe "form" (see Morpheus)
(pl. loci), 1715, "locality," from L. locus "place," from tin stlocus, lit. "where something is placed,"
2、等位基因（allele）:位于一对同源染色体的相同 基因座上的DNA片段互称等位基因。
28
DMD基因的克隆
• X染色体隐性遗传
– 多为男性患者 – 家系隔代传递
• 女性患者（X-常染色体平衡易位） • 新生突变
一个无任何遗传缺陷家族史的男孩，患有DMD等4种X 连锁隐性遗传病。 细胞遗传学分析显示Xp21.1微缺失。
29
DMD基因的克隆
• 两个研究小组分别采用两种不同的方 法克隆了DMD基因：
• 更多的疾病未涉及到染色体变异
• 遗传标记与连锁分析
32
致病基因的定位与克隆
Nov.14, 2012 北京协和医学院 王铮
1
两个问题
• 什么是基因? • 基因在哪里?
2
基因和染色体
• 基因 ——国家
• 染色体——大陆
3
基因定位
• 确定基因在染色体/基因组上的真实位置。
• 目的：构建临床表型——基因突变的桥梁
个体化治疗
4
复习：基本概念
1、基因座（locus）: 指一条染色体上的特定位置。