苯酚-硫酸法
苯酚硫酸法测多糖含量计算公式
苯酚硫酸法测多糖含量计算公式多糖是一类高分子化合物，由多个单糖分子通过糖苷键连接而成。
多糖广泛存在于天然产物中，如植物、动物、微生物等。
多糖具有多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等，因此在医药、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。
测定多糖含量是多糖研究的基础，其中苯酚硫酸法是一种常用的测定方法。
苯酚硫酸法是一种比色法，其原理是将多糖与苯酚在硫酸存在下加热，生成一种紫色化合物，其吸光度与多糖含量成正比。
该方法具有操作简便、灵敏度高、重现性好等优点，因此被广泛应用于多糖含量的测定。
苯酚硫酸法测定多糖含量的计算公式如下：多糖含量（%）=（A-B）×V×D/（C×m）其中，A为待测样品的吸光度值，B为空白对照的吸光度值，V为总体积，D为稀释倍数，C为苯酚硫酸试剂的浓度，m为样品的质量。
在进行苯酚硫酸法测定多糖含量时，需要注意以下几点：1.样品的制备：多糖样品需要经过适当的处理，如粉碎、溶解、过滤等，以获得均匀的样品。
2.空白对照的制备：空白对照是指不含多糖的样品，其制备方法与待测样品相同。
3.苯酚硫酸试剂的制备：苯酚硫酸试剂需要在使用前制备，其制备方法为将苯酚和浓硫酸按一定比例混合，制成苯酚硫酸试剂。
4.吸光度的测定：吸光度的测定需要使用紫外可见分光光度计，选择合适的波长进行测定。
5.计算公式的应用：在进行计算时，需要注意各参数的单位，如体积的单位为毫升，质量的单位为克。
苯酚硫酸法是一种简便、灵敏、重现性好的多糖含量测定方法，其计算公式简单易懂，适用于多种多糖的测定。
在进行测定时，需要注意样品的制备、空白对照的制备、苯酚硫酸试剂的制备、吸光度的测定以及计算公式的应用等方面，以保证测定结果的准确性和可靠性。
苯酚
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
1．浓硫酸：分析纯，95.5%2．80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3．6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5．15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6．5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7．6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8．6mol/L 盐酸1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml 水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。
苯酚-硫酸法快速测定多糖方法的优化
1.2.3 单因素试验设计以100μg/mL 葡萄糖标准溶液200μL 为研究对象，酶标仪检测波长为490nm 时的OD 值作为评价指标，分别考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、浓硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反应温度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反应时间(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素对OD 490nm 值的影响[6]。
1.2.4 正交优化试验在1.2.3单因素试验结果的基础上，选择苯酚用量(A)、浓硫酸用量(B)和反应温度(C)3个因素为自变量，以OD 490nm 值为评价指标，进行L9(33)正交试验，试验因素及水平见表1。
表1 正交试验因素水平表2200700803300800901.2.5 标准曲线制作以蒸馏水为空白，分别精密吸取浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，在每支离心管中加入5%苯酚溶液200μL 、浓硫酸700μL 后，迅速摇匀，80℃水浴10min 后，冷水浴5min 终止反应，精密吸取各反应液加入96孔酶标板，每个样品加3个孔，每孔200μL ，采用酶标仪在490nm 波长下测定OD 值，以葡萄糖浓度为横坐标，OD 490nm 值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.6 酶标仪测定多糖的可行性分析精密吸取浓度为40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、浓硫酸反应后，酶标仪测定OD 490nm 值，并根据标准曲线计算多糖含量。
2 结果与分析2.1 酶标仪检测波长的确定采用苯酚-硫酸法对葡萄糖标准品进行测定，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm 波长范围内进行扫描，结果如图1所示，葡萄糖标准品在490nm 处有最大吸收峰，故可选择490nm 作为酶标仪检测波长。
苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量 标准作业指导书
产品质量胞外多糖的测定
1目的
依据有关方法和标准，建立公司测量土壤中胞外多糖的标准方法。
2适用范围
本文件规定了测定胞外多糖含量的苯酚-硫酸法。
本实验采用苯酚-硫酸法，该实原理是：浓硫酸水合产生的高温快速分解多糖产生单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，生成的糖醛衍生物又与苯酚反应生成橙黄色化合物，再以比色法测定
本标准适用于蓝藻门、绿藻等藻类胞外多糖的测定。
3参考文件
无
4定义
胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS):是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。
5职责
5.1测试工程师依照国家标准的更新、或者方法的改良，不定期更新本文件。
5.2测试工程师应当对测试人员进行培训、考核、上岗认定和定期技能查验，对于技能不达标的人员予以相关处理。
5.3测试人员应当严格依照本文件方法测定相关样品的胞外多糖含量，保证安全的情况下，认真仔细地完成实验。
6程序
6.1试剂和材料
表1准备试剂和材料清单
表2混合材料和溶液配置清单
6.2仪器设备
表3仪器设备清单
6.3操作流程表
表4胞外多糖的测定操作流程表
6.4具体操作流程
表5胞外多糖的测定具体操作
7附件
附件1《实验室测试报告》。
苯酚硫酸法测多糖含量
一、硫酸苯酚法测多糖含量1、试剂配制1. 浓硫酸：分析纯，95.5%2. 5%苯酚：取苯酚5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。
3. 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。
准确称取20m g经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。
2、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5%苯酚1ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
1 2 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 （mL）蒸馏水（mL ）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3 注意事项（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算（4）测定时根据光密度值确定取样的量。
光密度值最好在0.1——0.3之间。
比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
（5）正常的反应溶液是深棕色。
糖越多颜色越深。
注意硫酸的纯度。
空白的颜色很深，说明你的空白中的苯酚被氧化了深红是醌（苯酚氧化生成）的颜色颜色过深的话说明你的酚的难度过大，一般是5%但是没遇到你说的那么严重，不是深红色的做的好的时候颜色很浅，颜色深点也有肯能。
苯酚-硫酸法测多糖含量
苯酚-硫酸法测多糖含量原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
试剂1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8． 6mol/L 盐酸操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。
苯酚硫酸法测多糖含量
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制1. 浓硫酸：分析纯，95.5%2. 5%苯酚：取苯酚5 g ，置100 ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。
3. 标准葡聚糖（Dextr a n,瑞典Pharm a cia ）或分析纯葡萄糖。
准确称取20m g 经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml 容量瓶中，蒸馏水溶解定容。
2、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg 于250ml 容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml ，各以蒸馏水补至1.0ml ，然后加入5%苯酚1ml 及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min 以后于490n m 测光密度，以1.0ml 水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
12 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液（mL ） 0.20.30.40.50.60.70.80.9蒸馏水（mL ） 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL ） 2.52.52.52.52.52.52.52.52.5葡萄糖标准曲线y = 54.353x + 0.0018R 2 = 0.999400.10.20.300.0010.0020.0030.0040.0050.006葡萄糖浓度（mg/ml）吸光值3 注意事项（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg 数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算（4）测定时根据光密度值确定取样的量。
苯酚—硫酸法测多糖
苯酚-硫酸法测多糖
实验结果
CL菌株在发酵过程中并不产胞外多糖，可以断定 抗菌物质不是多糖。 但是利用 Bradford 法测蛋白质，发酵前后蛋白质 含量有明显变化，但是并不能断定抗菌物质是蛋 白质类，有可能是 CL菌株产的胞外蛋白酶类，使 蛋白质含量发生变化。为探索其物质可能还需要 进一步验证
实验步骤
苯酚—硫酸法测多糖
试剂：
（1）90%的苯酚溶液：
称取90克苯酚，加蒸馏水10ml，在室温下可保存数月
（2）9%苯酚溶液： 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水30ml，现配现用 （3）浓硫酸
实验步骤
苯酚—硫酸法测多糖
2ml（水、空白培养基、无菌发酵液）+1ml 9% 苯酚+5mFra bibliotek 浓硫酸 =8ml
恒温条件下，30min后测A485nm
实验步骤
Bradford法测蛋白
试剂：
Bradford储存液 100ml 95%乙醇 200ml 88%磷酸 350mg Serva G蓝 Bradford 工作液 425ml 双蒸水 15ml 95%乙醇 30ml 88%磷酸 30ml Bradford贮存液 Whatman 1号滤纸过滤，保温 与室温棕色瓶中，可使用数周， 但使用前需要过滤
2min测A595 1h内完成
室温下长期保持稳定
100µl蛋白质溶液+1ml 工作液
实验步骤
培养温度与初始pH对抑菌效果的影响:
1. 取 OD=0.4 的 CL 菌株 1ml 分别接入初始 pH 为 4.0 、 5.5 、 7.0 、 8.5 的 100ml 海水牛肉膏蛋白胨培养基 中，25℃ 170r/min振荡培养4d
实验结果
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简介
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
原理
多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
试剂
1．浓硫酸：分析纯，95.5%
2．80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3．6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）
4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5．15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6．5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7．6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8．6mol/L 盐酸
操作
1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：
①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
）
③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。
定容至25毫升的容量瓶中。
吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。
每次测定取双样对照。
以标准曲线计算多糖含量。
注意
（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（4）测定时根据光密度值确定取样的量。
光密度值最好在0.1——0.3之间。
比如：小
于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。