分子生物学：重组和转座
分子生物学 转座子 相关
第十五章转座子基因组是通过获得新序列以及原有序列重排发展而来的。
新序列的意外引入改变基因组间承载信息的能力。
染色体外元件(Extrachromosomal element)通过调节基因的长度(通常是很短的)来转移信息。
在细菌中，质粒是通过接合作用(见12章)，而噬菌体则是通过感染来转移信息(见第11章)。
噬菌体和质粒都会在其复制子(Replicon)中偶尔携带一些宿主基因。
有些细菌中有通过转化作用直接转移DNA的现象。
真核生物中，一些病毒(尤其是逆转录病毒)能够在感染周期内转移遗传物质。
重排(Rearrangement)是由基因组内部程序发起的，例如非互惠(Nonreciprocal)重组是由同源重组时错配导致的。
非互惠重组导致座位的复制或重排(见第4章)。
基因组的序列复制是产生新序列的主要来源。
复制可能继承原来的功能或可能产生新功能，而且，在分子水平上发现独立基因组间差异明显，是由于重组导致了这些多态性(Polymorphism)。
在第4章已经讨论过，微卫星间重组可调整其长度以便使每个基因组都是独特的。
多态性的另一个主要原因是由转移元件转座(Transposon)产生的：它们是基因组中可移动的不连续序列，可在基因组内从一个座位转到另一个座位。
转座子特征是它们并不利用独立元件(如噬菌体或质粒DNA)，而只是从基因组的一个位点直接移动到另一个位点，与大多数基因组重构的其它程序不同，转座子不依赖序列供体和接体位点间的任何联系。
转座子非常严格地自我转座到同一基因组的新位点，有时增加一些序列，因此它们可作为基因组间序列转移的内部载体，是基因组内突变的主要来源。
转座子可分两种类型。
本章讨论的转座子与编码蛋白质的DNA序列共存并操纵这些DNA以便使其在基因组内复制自我。
下章讨论的转座子与逆转录病毒相似。
它们通过将RNA转录成DNA拷贝的能力而迁移；DNA拷贝同时被整合进基因组的新位点。
通过DNA移动的转座子在真核和原核生物中都已发现。
分子生物学 第五章 DNA的转座
转座作用
DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导 的遗传物质重排现象。
“转座”？
不十分准确，在转座过程中，可移位因子的一个 拷贝常常留在原来的位置上，在新位点出现的是 拷贝，因此，转座有别于同源重组，它依赖于 DNA的复制。 根据转座子复制与否，转座作用可分为:
单纯转移 复制转移
5.1转座子 转座子
5.4.3 TnA家族 家族
TnA家族都是比较大的转座子（-5kb以上）， 家族都是比较大的转座子（ 以上）， 家族都是比较大的转座子 以上 其特点是两端不含IS， 其特点是两端不含 ，但含有独立的转位酶基 因和抗药性基因。 因和抗药性基因。TnA家族包括许多类似的转 家族包括许多类似的转 位子。它们的一般结构均相类似， 位子。它们的一般结构均相类似，但有不同的 遗传标记(genetic markers)。 遗传标记 。
5.4.1 Tn10 许多转位子两端的IS具有完全相同的反向 许多转位子两端的 具有完全相同的反向 或同向）重复顺序。但亦有些Tn两端 两端IS不 （或同向）重复顺序。但亦有些 两端 不 完全相同，从而引起其功能各异。例如Tn10 完全相同，从而引起其功能各异。例如Tn10 两端的IS（右侧IS10R，左侧为 两端的 （右侧 ，左侧为IS10L）即不 ） 完全相同。 完全相同。
IS10L Tn10 (9.3 kb) IS10R
IR IR
பைடு நூலகம்IR
IR IR
IR
两端的反向重复顺序长22bp。这 在IS10两端的反向重复顺序长 两端的反向重复顺序长 。 个22bp的反向重复即是转位酶所赖以识 的反向重复即是转位酶所赖以识 别的位点，因而为转位反应所必须。 别的位点，因而为转位反应所必须。由 的反向重复不完全相同， 于IS10R和IS10L的反向重复不完全相同， 和 的反向重复不完全相同 所以IS10R是Tn10转位所必须，而IS10L 转位所必须， 所以 是 转位所必须 的转位活性却仅为IS10R的1-10％（目前 ％（目前 的转位活性却仅为 的 ％（ 估计IS10R和IS10L之间约有 ％的差 之间约有2.5％ 估计 和 之间约有 异）。
分子生物学：重组和转座
转座子的特点
转座子是不必借助同源序列就可以移动的片断,即转座作用与供体 和受体的序列无关;
原核生物和真核生物都有转座子; 转座序列可沿染色体移动,甚至在不同染色体间跳跃(跳跃基因) 转座子对基因组而言是一个不稳定因素，它可导致宿主序列删除、
倒位或易位，并且其在基因组中成为“可移动的同源区”。位于 不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组，从而造成基 因组不同形式的重排。 有些转座子与基因组的关系犹如寄生，它们的功能只是为了自身 的扩增与繁衍，因此被称为是自私的DNA。
转座中涉及的机制依赖于DNA 链的切割和重接，因此 （branch migration）
Cro蛋白抑制C I基因的转录，它占优势噬菌体即进入繁殖周期，并导致宿主细胞裂解。
与重组过程联系起来。 二者含有共同的核心序列15bp（O区）。
DNA转座子上携带作为重组位点的DNA序列，以及参与重组的蛋白质的基因（转座酶基因）。 同源重组 (homologous recombination )或普遍性重组（generalized recombination ）
复制式转座 如 Tn3
非复制式转座 如 Tn10
类病毒反转录转座子/反转录病毒
带有反向终端重复序列.反向终端 重复序列嵌入在较长的正向排列的 重复序列(长末端重复序列, long terminal repeats LTR)中；
带有靶位点重复序列； 类病毒反转录转座子编码两种移位所需的蛋白：转座酶和反转录酶。 类病毒反转录转座子和反转录病毒的区别在于：反转录病毒的基因
径的歧化做好准备。
位点特异性重组与同源重组的区别
带有2个基因ORF1和ORF2；
同源重组 (homologous recombination )或普遍性重组（generalized recombination ）
分子生物学—名词解释
顺反子:即结构基因,是一段核苷酸序列,能编码一条完整的多肽链。
断裂基因（split gene）：在真核生物基因组中，基因是不连续的,在基因的编码区域内部含有大量的不编码序列，从而打断了对应于蛋白质的氨基酸序列。
这种不连续的基因又称断裂基因或割裂基因。
内含子(intron)：真核生物基因中，不为蛋白质编码的、在mRNA加工过程中消失的DNA 序列,称内含子。
外显子(exon)：真核生物基因中，在mRNA上出现并代表蛋白质的DNA序列，叫外显子. 衰减子（attenuator):指原核生物的操纵子中明显衰减乃至停止转录作用的一段核苷酸序列,位于操纵子上游。
SD序列:原核生物中含有的一段位于起始AUG序列上游10nt左右的富有嘌呤碱基的区域启动子(promoter)：DNA链上能指示RNA转录起始的DNA序列称启动子。
RNA剪接（RNA splicing）:从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子,并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。
RNA编辑(Edit）：在mRNA水平上改变遗传信息的过程。
具体说来，指基因转录产生的mRNA分子中，由于核苷酸的缺失,插入或置换,基因转录物的序列不与基因编码序列互补，使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成，不同于基因序列中的编码信息现象。
反密码子（anticodon)：位于tRNA反密码环中部、可与mRNA中的三联体密码子形成碱基配对的三个相邻碱基.在蛋白质的合成中，起解读密码、将特异的氨基酸引入合成位点的作用.miRNA：在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20~25个核苷酸。
结构域（domain)：蛋白质三级结构被分割成一个或数个球状或纤维状折叠较为紧密的区域，各行其功能，该区域称为结构域。
蛋白家族（protein family)：具有序列相似性基因表达的产物。
转录因子（TF)：专为构建起始复合物的基本转录因子，以及在转录过程中调节RNApol 活性的转录调控因子，这两类蛋白因子的统称可读框（ORF）：是指从起始密码子起到终止密码子为止的一段连续的密码子区域;或在DNA序列测定中由计算机系统辨认出的可能编码区域,始于ATG，止于TGA、TAA或TAG的连续密码子区域。
分子生物学 第四章
DNA聚合酶 填补碱基
DNA连接酶
核苷酸切除与UvrAB修复系统
错配修复中子代DNA的识别
针对复制错误，所以发 生与子代DNA分子
一个问题：如何区分子 代DNA分子?
大肠杆菌中子代新生分 子尚未甲基化，从而可 以区分
甲基化位点： 5’-GATC-3’ A甲基化 5’-CCA/TGG-3’ C甲基化
Holliday模型的缺陷与 Meselson-Radding修正模式
Holliday模型的缺 陷：切口是如何出 现在两条分子的同 一位置的？
单分子切口 切口链侵入未打开
的双螺旋，形成D环 被取代链断开，形 成另一个分子上的 切口 修正：在两分子切 口形成过程中引入 交换的D环
Holliday模型修正后无法解释 基因转换
物理和化学诱变导致突变
化学： 1）碱基类似物替代标准碱基参 与复制 5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤 2）脱氨 3）烷化 4）嵌入 溴化乙锭
物理： 1）紫外辐射 形成嘧啶二聚体 2）电离辐射 3）加热
突变可能不影响基因组
存在很多不影响基因组功能的突变 沉默突变：
1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域， 对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因 组的98.5%。 2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同 义突变
重组的一般类型----同 源重组（一般性重组）
位点特异性重组（同源 区很短）
转座
同ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ重组
可发生于两条 同源DNA的任 意位点
真核生物中， 发生于减数分 裂时期
重组是由于异源双链体DNA间发 生断裂与重连
两条双链DNA分子间的重组关 键是单链的交换
分子生物学第7章 DNA的重组与转座
7.2.1 λ phage DNA的整合与切除 1、实现机制：
均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组
2、特定位点-----附着位点（attachment site att）
◘ 整合过程需要λ整合酶 （integrase Int）（λ编码）
和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用
◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’）
溶菌周期 （lysis）
溶源性细菌 原噬菌体 (lysogen)
4、整合分子机制
5’
5’
b
3’
酶切
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
(3) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(4) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(5) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(6) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(7)
A
B 3’
5’
b
5’
b
3’
游离端移动联会
B 3’
(10)
A
5’
B
5’
b 3’ 游离端交叉连接
一、位点特异性重组（ site-specific recombination） 1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间 的重组
噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组
2、特征：
在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接---产生精确的DNA 重排 都具有整合作用的两个基本特征
生物化学及分子生物学(人卫第九版)-23 DNA重组和重组DNA技术
二、载体
原核表达载体
——用于在原核细胞中表达外源基因 ——除了具有克隆载体的基本特征外，还有供外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列， 如启动子、核糖体结合位点即SD序列（Shine-Dalgarno sequence）、转录终止序列等
二、载体
真核表达载体
——除了具备克隆载体的基本特征外，所提供给外源基因的表达元件是来自真核细胞的。
3. CRISPR/Cas系统是细菌的获得性免疫机制
当噬菌体再次感染宿主菌时
•CRISPR座位转录产生pre-crRNA
•tracrRNA基因转录产生tracrRNA •tracrRNA与pre-crRNA在cas9作用 下形成引导RNA（gRNA）-cas9复合 物 •gRNA-Cas9复合物靶向病毒DNA并 将其切割消化
克隆载体
——是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子。
克隆载体的基本特点：
至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源DNA片段得到
同步扩增； 至少有一个选择标志（selection marker），从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如 抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等； 有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。
第二节
重组DNA技术
序言：
重组DNA技术
又称： 分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因工程（genetic engineering） 主要过程：
——在体外将目的DNA与能自主复制的遗传元件（载体）连接， 形成重组DNA分子 ——重组DNA分子在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得 单一DNA分子的大量拷贝
分子生物学—同源重组、位点专一性重组、转座
分⼦⽣物学—同源重组、位点专⼀性重组、转座同源重组遗传交换、染⾊体上基因重排、断裂DNA的修复（1）同源重组的形式常发⽣在同源染⾊体之间（分⼦间重组）也可发⽣在同⼀DNA分⼦内（分⼦内重组）（2）Holliday 模型解释同源重组的⼀个经典模型基于重组过程中有⼗字形的中间产物（3）RecBCD重组途径存于E. coli中，需要RecBCD蛋⽩（RecBCD protein，recB、recC、recD基因的产物）参与DNA损伤造成的双链断裂以及外源DNA线性分⼦的DNA断端。
RecBCD是⼀种具多功能的酶，依赖于DNA的ATPase(⽔解ATP, 为DNA的解螺旋提供能量)；DNA helicase; DNA nuclease,可作⽤于单链或双链DNA, 切割χ位点（GCTGGTGG）χ(chi): crossover hotspot instigator RecBCD的切点与底物的序列有关，可在χ位点3’端4 ~ 6 ntRecA ：38 kD 的蛋⽩质，具多种功能，在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是⼀单链与⼀双链中的同源单链交换）；交换过程需ATP。
RuvA和RuvB ：RuvA和RuvB均具DNA helicase活性，RuvB还有ATPase活性；RuvA特异性识别并结合到Holliday junction，并促使RuvB蛋⽩结合到这⼀位点；RuvB⽔解ATP，提供能量，促使分⽀迁移RuvC ：解开Holliday junction的核酸内切酶，特异地与Holliday junction结合，在特异位点切开Holliday junction。
RuvC是⼆聚体，有2个活性位点，能切开Holliday junction的两条链，切割位点有特异的序列，必须等branch migration 到达特异序列后，RuvC才能起作⽤，以何种⽅式解开Holliday junction取决于RuvC切割位点在两对同源单链上的频率。
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1983年McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖，距离她公布玉 米控制因子的时间已有32年之久。
所有生物的基因组中均有转座子
组被包装到病毒颗粒内，离开宿主细胞再去感染新的细胞；类病毒 反转录转座子只能移位到一个新的DNA位点，不会离开宿主细胞
聚腺苷酸反转录转座子
不含终端反向重复序列；它的两端含有完全不同的序列: 5‘UTR (untranslated region), 3’UTR (untranslated region) 和poly-A序列；
位点特异性重组
位点特异性重组是在专一酶的作用下，在DNA 特异性序列之间进行重组。
此过程往往发生在一个特定的短的（20-200bp） DNA序列内（重组位点）。
噬菌体溶原途径的整合、抗体基因的重排等都 是位点特异性重组。
位点特异性重组与同源重组的区别
位点 酶、蛋白
断裂
位点特异性重组 同源短序列 专一的酶 特异位点
两端也有短的靶重复序列（target site duplications）; 带有2个基因ORF1和ORF2；ORF1 编码一个RNA结合蛋
白；ORF2编码的蛋白同时具有反转录酶和核酸内切酶作 用，在重组中起着关键作用。 有自主转座子（如LINE）和非自主转座子（如Alu因子） 两种。
LINE：long interspersed element, 长散布因子
2. 位 点 特 异 性 重 组 (site-specific recombination)
3. 转座重组：转座子 4. 模板选择（copy choice）
RNA病毒
同源重组
Holliday模型
分支端化 （branch migration）
Holliday模型的疑问
Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但 也存在问题。
转座重组会破坏染色体上基因的排列顺序。
转座子的发现
20世纪40年代，美国遗传学家Barbara McClintock在研究玉米的 遗传因子时发现，某些基因活性受到一些能在不同染色体间转移 的控制因子（controlling element）所决定。这一发现与当时传 统的遗传学观点相抵触，因而不被学术界所普遍接受。
第二章 染色体与DNA
遗传物质的分子结构和性质 基因组和染色体 DNA的复制 DNA损伤与修复 重组和转座
没有遗传重组就没有进化
没有遗传重组就没有进化Fra bibliotek重组1. 同 源 重 组 (homologous recombination ) 或 普 遍 性 重 组 （generalized recombination ） 真核生物中发生在减数分裂期
λ噬菌体的整合
λ噬菌体DNA编码的λ整合酶(λintegrase,Int)能指导噬 菌体DNA插入E.coli染色体DNA中。
λ整合酶在λ噬菌体与宿主的两个特定位点之间催化重 组的进行，这两个特异重组位点称为附着位点(att)。
噬菌体的附着位点att P 长度240bp，以POP’表示；细 菌相应的附着位点att B 只有23bp，以BOB’表示。二 者含有共同的核心序列15bp（O区）。
最简单的细菌转座子——插入序列
产生于重组过程
靶重复序列的形成
转座子带有自身的转座酶的基因，除此之外也可能会携带 一些其它基因（编码的蛋白质可能调控转座或为转座子或 宿主细胞提供一些价值的功能）
转座作用的机制
按转座子转座过程是否发生复制，可分为： 非复制转座(nonreplicative transposition)：又称 为保留性转座(conservative transposition)，转 座子从原来位置上切除下来转入新的位置，其两 条链均被保留。 复制转座(replicative transposition)：则在形成靶 部位与转座子连接中间体后即进行复制。通过复 制使原来位置与新的靶部位各有一个转座子。
转座子的特点
转座子是不必借助同源序列就可以移动的片断,即转座作用与供体 和受体的序列无关;
原核生物和真核生物都有转座子; 转座序列可沿染色体移动,甚至在不同染色体间跳跃(跳跃基因) 转座子对基因组而言是一个不稳定因素，它可导致宿主序列删除、
倒位或易位，并且其在基因组中成为“可移动的同源区”。位于 不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组，从而造成基 因组不同形式的重排。 有些转座子与基因组的关系犹如寄生，它们的功能只是为了自身 的扩增与繁衍，因此被称为是自私的DNA。
λ噬菌体DNA进入宿主大肠杆菌细胞后存在溶源和裂解两条 途径，二者的最初过程是相同的，都要求早期基因的表达， 为溶源和裂解途径的歧化做好准备。
两种生活周期的选择取决于C I和Cro蛋白相互拮抗的结果。 C I蛋白抑制除自身外所有噬菌体基因的转录，如果C I蛋白 占优势，溶源状态就得到建立和维持。Cro蛋白抑制C I基因 的转录，它占优势噬菌体即进入繁殖周期，并导致宿主细 胞裂解。
2. 位 点 特 异 性 重 组 (site-specific recombination)
3. 转座重组：转座子 4. 模板选择（copy choice）
RNA病毒
重组
1. 同 源 重 组 (homologous recombination ) 或 普 遍 性 重 组 （generalized recombination ） 真核生物中发生在减数分裂期
转座子类型
有三类转座因子: DNA转座子. 类病毒反转录转座子和反 转录病毒 . 聚腺苷酸反转录转座子,也 称非病毒反转录转座子
DNA转座子
DNA转座子上携带作5’-为CC重CA组GA位C-点3’ 的DNA5序’-G列TC，TG以GG及-3’参 与重组的蛋白质的基3因’-G（GG转TC座TG酶-5’基因）。3’-CAGACCC-5’
转座重组
有一种异常的重组类型，是一段DNA 序列插入到另一 段DNA 序列中，而不依赖于序列同源性。
这种使某些元件从一个位置向其他位置的移动方式是 转座(transposition)。这段可以发生转座的DNA元件， 称为转座子(transposon )
转座中涉及的机制依赖于DNA 链的切割和重接，因此 与重组过程联系起来。
同源重组 同源大片段
RecA 随机
重组位点的特性
每个重组位点由一对对称排列的重组酶识别序列构成， 识别序列中间是一个短的不对称序列，称为交换区 （crossover region ），DNA 的断裂和重新连接就发 生在交换区。
λ噬菌体DNA的整合与切除
最早研究清楚的位点特异性重组是λ噬菌体DNA在宿主染色 体上的整合与切除。
转座子两端的重组位点以反向重复排列（25-几百bp），
5’-ATAGCCTGA-3’ 5’-ATAGCCTGA-3’
并且带有重组酶（3’转-TA座TC酶GG，ACtTr-a5n’ spo3s’a-TsAeTsC；GG有AC时T-5称’ 整 合酶，integrases）识别序列。 靶重复序列（target site duplications ）是紧邻在转座 子两端的短的重复序列（2-20bp ），为正向排列；产 生于重组过程。
该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时
需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子
单链断裂是经常发生的事，但如何保证两个分 子能在同一位置发生断裂？
同源重组的 RecBCD途径
Chi位点(5’-GCTGGGTGG-3’)是 目前发现的主要的重组热点。 E.coli 平 均 每 5000bp 就 有 一 个 Chi 位 点 ， 含 有 大 约 1000 个 Chi 位点，亦即每五个基因就有一个 Chi位点，这些Chi位点中很多在 细菌的接合和转导过程中作为重 组热点而刺激同源重组的发生。
复制式转座 如 Tn3
非复制式转座 如 Tn10
类病毒反转录转座子/反转录病毒
带有反向终端重复序列.反向终端 重复序列嵌入在较长的正向排列的 重复序列(长末端重复序列, long terminal repeats LTR)中；
带有靶位点重复序列； 类病毒反转录转座子编码两种移位所需的蛋白：转座酶和反转录酶。 类病毒反转录转座子和反转录病毒的区别在于：反转录病毒的基因