基因工程的工具酶解析

合集下载

基因工程中常用的三种工具酶

基因工程中常用的三种工具酶

一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)1.定义:凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶,也称为限制酶(restriction enzyme,RE)。

2.类型:来自原核生物,有三种类型。

Ⅰ型:兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性,随机切割。

Ⅱ型:大多能特异识别4~6个核苷酸序列(回文结构),最大识别序列为8个核苷酸,如SfiI、NotI;但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构,如SfaNI、MnlI等,Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。

另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列,将这类酶特称为同工异源酶(isoschizomers)或同裂酶。

同工异源酶切割产生相同的末端;有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别,故可用来研究DNA 甲基化作用,如SmaI和XmaI;HpaII和MspI;MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶;其中HpaII和MspI是一对同工异源酶,其识别位点是CCGG。

与同工异源酶对应的一类限制酶,它们虽然来源各异,识别序列也各不相同,但都产生出相同的粘性末端,称为同尾酶(isocaudamers)。

常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶,它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

显而易见,由同尾酶所产生的DNA片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的,因此在基因克隆实验中很有用处。

但必须指出,由两种同尾酶消化产生的粘性末端,重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。

Ⅲ型:功能基本同Ⅰ型,但为特定位点切割。

三种限制酶的区别如下表所示:Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定(于识别序列前后100~1000bp范围之内)特定(切割于识别序列之中或近处,固定位点)特定(切割点在识别序列后25~75bp处)与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3.命名:第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第四个字母代表株。

基因工程的工具酶

基因工程的工具酶
稳定性
03
应用领域:基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势:定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向,推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用:作为构建基因电路的关键元件,实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势:更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景:利用工具酶进行药物设计和生产,提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景:利用工具酶进行污染治理和生态修复,保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗:工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学:工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展:工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望:工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用:基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能:连接 DNA片段,形 成重组DNA
特点:高效、 特异性强、稳 定性好
应用:基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型:T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能:在基因工程中,聚合酶用于切割和连 接DNA,以实现基因的插入、删除和修改
工具酶:基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用:在基因突变的研究中,
实例:例如,使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA,然后使用DNA连

基因工程基因工程工具酶

基因工程基因工程工具酶

基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。

在基因工程的过程中,基因工程工具酶发挥着关键的作用。

本文将介绍几种常用的基因工程工具酶,包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。

一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶(Restriction Enzyme)是一类具有特异性切割DNA双链的酶。

它可以识别并切割DNA的特定序列,通常这个序列是对称的,在切割后会产生特定的片段。

1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。

它们通常识别的序列是4到8个碱基对长,具有一定的对称性。

一旦内切酶与特定序列结合,它会切断DNA的链,在特定的位置形成断裂,从而将DNA切割成特定的片段。

1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。

它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。

通过选择适当的限制性内切酶,可以对DNA进行特定的切割和连接,从而实现对目标基因的定向操作。

二、连接酶2.1 定义连接酶(Ligase)是一种酶类,能够将两条DNA片段连接起来。

在基因工程中,连接酶通常被用于连接目标基因和载体。

2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。

它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起,形成一个新的DNA分子。

2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。

它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。

通过连接酶的作用,可以将多个DNA片段连接起来,构建出符合需要的重组DNA分子。

三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。

在基因工程中,修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。

3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。

它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。

3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。

它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。

第三章 基因工程工具酶

第三章 基因工程工具酶
如:Ⅱ型酶需 Mg2+,若以 Mn2+ 代替 代替Mg2+(如 , ( HindⅢ,EcoRI)则特异性改变。 Ⅲ )则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 离子浓度不合适会抑制酶活。
(3)牛血清蛋白 (BSA)
BSA 是酶稳定剂,可避免热、表面张力、化学品导致 是酶稳定剂,可避免热、表面张力、 的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 的酶变性。 会引起电泳拖尾。
Ⅱ类 R-M 系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两 种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲 基化酶。 甲基化酶也称修饰酶 (modification enzyme),用 来修饰限制酶的识别序列,在该序列位点的胞嘧啶 (C)5- 氨基上加一个甲基,使得该序列可以被限 制性内切酶识别而免于切割。
甲基化酶分两类: 甲基化酶分两类:
第三章 基因工程工具酶
基因工程工具酶
基因工程的操作,是在分子水平上的操作, 基因工程的操作,是在分子水平上的操作, 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶,连接酶, 是依赖一些酶 如限制性核酸内切酶,连接酶, 如限制性核酸内切酶 DN聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割, 聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割 聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割, 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“ 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工 具酶” 工具酶是对野生菌株( 具酶”。工具酶是对野生菌株(或真核生物如 酵母)进行改造、优化、 酵母)进行改造、优化、而产生的生物工程产 品。
DNA连接酶(ligase) 连接酶( 连接酶 )
能够催化 DNA 中相邻的 3’-羟基和 5’-磷酸 基末端之间形成3′,5′-磷酸二酯键; T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子,也可 使平端的双链 DNA 分子相互连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子.

基因工程-工具酶

基因工程-工具酶

基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中,实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基, 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶,开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用,用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学,工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具,用于切割、连接和修饰DNA分子,使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列,用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起,构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰,如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列,如聚合酶链反应(PCR)中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用,识别并结合到目标序列上,然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因,使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵,生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制:某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题:基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑:对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管:基因工程面临严格的法律和监管要求。

基因工程3-3基因操作的工具酶

基因工程3-3基因操作的工具酶
需要Zn2+作为辅助因子,最适pH是4.5,这是与基因 工程的其它工具酶不同的两个特点。 3. 在基因工程中的应用:
由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴,因而在 质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。 (1) 切除单链粘性末端,产生平末端,再用T4连接酶连接。 (2) 切除cDNA的发夹结构。
26
3.3 DNA聚合酶
DNA聚合酶 :能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到
双链DNA分子引物链的游离3’-OH末端,使核 苷酸发生聚合作用,而不从模板上解离。
反应特点 :
(1) 以四种三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)为底物 (2) 反应需要模板的指导,加入的核苷酸由模板链
所决定 (3) 聚合反应需要有引物存在,且引物要有3’-OH
Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端(5’延 伸末端)。
13
14
对于限制性核酸内切酶EcoR I切割后形成的5’ 延伸末端可用32PdATP标记:
而BamH I切割后形成的5’延伸末端可用
32PdGTP标记:
15
3.3.3 T4 DNA聚合酶 是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一
种特殊的DNA聚合酶。 1. T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶:
合成的方向移动——缺口平移(Nick
Translation)。 9
应用缺口平移法制备DNA杂交探针,其典型的 反应体系是:在25 l总体积中含有1 g纯化的特 定的DNA片段,并加入适量的DNase I、pol I、 32PdNTP和未标记的dNTP。
脱氧核糖核苷酸酶 I(DNase I)是一种内切酶, 它能够水解单链或双链DNA,形成带有5’-磷酸 末端的单(寡)核苷酸。
解方向有两种: * 从RNA链 5’末端外切:称5’ 3’外切RNA 酶 * 从RNA链 3’末端外切:称3’ 5’外切RNA 酶

基因工程操作的工具酶

基因工程操作的工具酶

也称为Kronberg酶,是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类: ①依赖于DNA的DNA聚合酶,包括大肠杆菌
DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶,有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA pol I):
.
21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸,这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列,在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’

基因工程所用到的酶

基因工程所用到的酶

基因工程所用到的酶基因工程中所用到的酶。

一、限制性核酸内切酶。

1. 作用。

- 限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列,并在特定的位点切割DNA分子。

例如,EcoRⅠ识别的序列是GAATTC,它会在G和A之间切割DNA双链。

这种酶在基因工程中的作用至关重要,它就像是一把“分子剪刀”,可以将目的基因从供体DNA中精准地切割下来。

- 原因是基因工程常常需要将特定的基因片段进行分离和操作。

如果没有这种精确切割的酶,就无法准确获取目的基因,后续的基因重组等操作也就无法进行。

2. 类型。

- 限制性核酸内切酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

其中Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的类型。

- Ⅰ型限制性核酸内切酶的切割位点不固定,离识别位点较远,并且需要ATP、Mg²⁺和S - 腺苷甲硫氨酸等多种辅助因子,这使得其在基因工程中的应用受到限制。

而Ⅱ型限制性核酸内切酶只需要Mg²⁺作为辅助因子,它的识别序列和切割序列是固定的,通常是4 - 8个碱基对的回文序列,这使得它能够非常精准地切割DNA,方便基因工程操作。

Ⅲ型限制性核酸内切酶也需要多种辅助因子,且切割位点不固定,所以应用较少。

二、DNA连接酶。

1. 作用。

- DNA连接酶能够将两个具有相同粘性末端或者平末端的DNA片段连接起来。

在基因工程中,它的作用是将切割下来的目的基因与载体(如质粒)连接在一起,形成重组DNA分子。

例如,T4 DNA连接酶可以连接粘性末端和平末端的DNA片段,在构建基因表达载体时起到关键的连接作用。

- 原因是基因工程的核心是构建重组DNA分子,而将目的基因和载体连接是构建重组DNA的关键步骤。

如果没有DNA连接酶,目的基因和载体就无法形成一个完整的重组分子,也就无法将目的基因导入受体细胞进行表达。

2. 种类。

- 常见的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。

E.coli DNA连接酶只能连接粘性末端,并且需要NAD⁺作为辅助因子;而T4 DNA连接酶既能连接粘性末端,也能连接平末端,需要ATP作为辅助因子。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序 列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一 种内切核酸酶。
一、限制性内切酶的发现
附在E Coli上的噬菌体
(一)限制-修饰现象(restriction and modification)
Hind Ⅲ 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中分离到的第3个限制酶。
四、限制性核酸内切酶学特性
一般分子量为60kd,单链多肽,最适 pH 为 6~8; NaCl有抑制作用,能被Mg2+激活,巯基具有保护作
用; 对热不稳定,通常贮存于–20℃环境。为避免反复
Ⅱ,Ⅲ等。

属种 株序

名 名名 号
EcoRⅠ E co R Ⅰ
Hind Ⅲ H in d Ⅲ
HindⅡ H in d Ⅱ
HpaⅠ H pa / Ⅰ
菌株来源
Escherichia coli R Haemophilus influenzae d Haemophilus influenzae d Haemophilus parainfluenzaea
(二)寄主的限制与修饰
限制-修饰 : 细菌能将外来DNA片段在 某些专一位点上切断,从而保证其不为外 来噬菌体所感染,而其自身的染色体 DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以 保护,这种现象叫做限制-修饰
(三)限制-修饰系统的作用(特点)
菌株内具有与内切酶活性相当的DNA甲 基化酶;
甲基化酶能把甲基加到与限制性内切酶 结合位点相同序列的A或C的亚基上;
基因工程工具酶
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链,极性相反,反向平行 • 以中心为轴,向右盘旋
工具酶
工具酶是指能用于DNA和RNA分子 的切割、连接、聚合、反转录等有关的 各种酶系统称为工具酶。工具酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
Ⅲ型酶的作用方式 (引自Lewin,1997)
三、 限制性核酸内切酶的命名原则
用来源菌株属名的第一个字母(大写)和种名的前 两个字母(小写),构成基本名称。表示寄主菌的 物种名。(斜体)
一个字母(小写)代表菌株或型 。 若酶存在于质粒上,则需大写字母表示染色体以外
成分 同一菌株中存在不同的酶,用罗马数字顺序编号I,
甲基化使得靶位点不被内切酶切割掉。
(四)限制与修饰机理
限制与修饰由三个基因位点所控制: hsd R, hsd M, hsd S
➢ hsd R--编码限制性内切酶 ➢ hsd M--编码限制性甲基化酶 ➢ hsd S--控制两个系统的表达:协助上述两
种酶识别特殊的作用位点
由甲基化 酶和限制 性核酸内 切酶两种 酶活性配 合进行的
时间:1950’
人物与材料: ➢ T偶数噬菌体(Luria) ➢ λ噬菌体 & P2噬菌体(Bertani & Weigle):更 具代表性和普遍性
请看实验
K、B具有核酸内切酶,能将外源DNA切断,保护自 己的方式是在这些内切酶的位点上进行甲基化;
甲基化的方式:N6甲基-A或C5甲基-C。
C不具有核酸内切酶。
核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
基因工程常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
杂合位点(hybrid site):由一对同尾酶 分别产生的粘性末端共价结合形成的位 点。杂合位点一般不能再被原来的任何 一种同尾酶所识别。
MunI:5` - C A A T T G - 3`
同裂酶
同尾酶
5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5`
Bam ---3`
3`---C CTAG
G---5`
5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5`
Bgl II
5`---A
GATC T---3`
3`---T CTAG
A---5`
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平
头末端的载体和供体DNA片段连接,形成重组DNA分 子。
第一节 限制性核酸内切酶 Restriction enzymes
“分子 剪刀”
限制性核酸内切酶 — 在DNA上核苷酸的特定连
宿主的限制与修饰的作用: (1)保护自身DNA不受限制(修饰后), (2)破坏入侵的外源DNA(限制作用)。
基因工程中采用没有限制作用的菌株作受 体,使基因操作得以进行。
➢ r-M+限制缺陷,具有修饰作用。 ➢ r-M-限制缺陷, 修饰缺陷。
二、限制性核酸内切酶的分类
I类酶的作用方式 (引自Lewin,1997)
回文结构(Palindromic)
大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形 式,即这些核苷酸对的顺序是回文结构。
不同限制性内切酶切割的三种结果
粘性末端(blunt ends )
5′粘性末端 3′粘性末端
平头末端(blunt ends )
5′粘性末端
3′粘性末端
平头末端
五、同位酶与同尾酶
冻溶使酶失活,商品酶均含有50%甘油,使用时添加 相应的缓冲液稀释,降低反应液中甘油的浓度。
每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列,通常的识别序列 是4 bp ~6bp,有些则 为7bp~8bp,甚或多于 8bp。
多数限制酶的识别序 列为回文结构,在识别序 列内或其附近水解DNA链 中的磷酸二酯键。
同位酶(isoschizomer) : 也称同裂酶,识别位点的DNA序列相同
的一类限制性内切酶(切点不一定相同);
同尾酶(isocandamer) 酶切后产生的DNA粘性末端相同的一类
限制酶(识别位点序列不一定相同) 。如
BamHI, BclI,Bgl Ⅱ ,Sau3AI,XhoⅡ是一 组同尾酶。
相关文档
最新文档