Octet生物分子相互作用仪
Fortebio生物分子相互作用检测平台-中文版
ForteBio Inc.—艾瑞生物技术（上海）有限公司
• 公司的历史：
• 2004年成立，在美国加州Menlo Park, 英国London, 和中国 • 上海建有生产和技术中心
• 独到的技术：
• 新一代的label-free technology • 生物膜干涉技术BioLayer Interferometry Technology（ BLI ）
两个反射表面间距的改变对干涉光强度的影响
Relative Intensity
Internal Reference (reflection surface 1)
100%
Distance between the two reflecting
ℓ surfaces =
Interface with Liquid (reflection surface 2)
Minimum Sample Volume Dynamic Range Direct Q动态 范围浓度 (At high and low flow rates) Affinity range (approximate) 亲和力分析浓度 RMS System Noise系统方差 Read Capabilities使用范围 Sample Usage样品使用 Temperature Control控温 21 CFR Part 11 Compliance
ForteBio Octet的应用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• Binding KD亲和力检测 • On and off rates
• 结合解离速率
• Rank order
• 比较亲和力和结合解离速率的高低
Specificity of binding 结合特异性 • Yes / No kinetic screening动力学筛选 • Epitope binning（竞争）/ mapping（定位）
Fortebio Octet BLI 实验设计及数据获取-小分子动力学
Small Molecule Kinetics Assay:概述：Octet可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。
该SOP的目的在于为小分子动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。
此外，该SOP假定所有使用者已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。
考量及建议：1.检测小分子时，应当使用SSA sensor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该sensor是ForteBio公司目前唯一具备检测小分子灵敏度的传感器。
2.用于与小分子结合的蛋白或抗体必须先进行生物素化。
请参阅ForteBio技术说明书。
3.建议assay buffer为PBS+0.1%BSA+0.02%TW20+5%DMSO（如果为水溶性小分子，则无需加DMSO等有机溶剂）；4.设置protocol时，须设置两组SSA sensor，运行中第1组为实际检测用sensor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭后、用作阴性对照的sensor。
5.检测sensor与对照sensor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致——任何偏差将导致数据无法分析。
6.用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。
如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。
如蛋白较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的shift）。
蛋白生物素化7.如果需要有机溶剂溶解小分子，稀释样品时DMSO最终浓度建议保持在5%以内（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为1mM，DMSO为5%）。
8.建议对样品进行两轮筛选。
例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM（或者2被剃度稀释）获取高度可信的Kd。
分子相互作用仪
分子相互作用仪
分子相互作用仪是紫外可见光谱仪的一种，它可以用应用于各种化学及物理研究，用
以测定分子间的氢键，疏水轨道，硫键，氮键和静电力等分子间的相互作用。
它基于可变
温度光谱学和可变温度极化光谱学来看到被测物质特征衍射或粒子衍射光谱，以帮助研究
人员分析汽液平衡，形成气液混合状态，及聚合物的形成过程以及阻塞物质的反应速率等。
分子相互作用仪的操作原理是通过变温度的极化光谱学来将分子间的相互作用测定出来。
在常温情况下，研究人员可以检测到分子相互作用或物理相互作用，比如氢键，疏水
轨道等；在高温和低温情况下可以检测到分子相互作用，比如硫键和氮键等；而且还可以
检测不同温度下分子间的氢键与另一种类型的分子间相互作用的变化情况，可以用于研究
分子间的力学。
分子相互作用仪主要由操作部分和检测部分组成。
主要的操作部件包括光源，探测器，操纵玻璃，滤波器，红外探测器，显示和控制电路等。
检测部分除了主要的探测仪器系统外，还配备有微型温度控制模块，以控制测定温度的变化情况。
分子相互作用仪能够检测分子与分子间的相互作用，以及分子间的结构和力学效果，
这对于合成新材料、研究汽液分子平衡、分析生物分子以及聚合物及分子在气液界面凝聚、利用有机分子衍射研究物质结构、研究气体析出及冷凝机理等方面有很重要的作用。
它还
可以更新分子间的旋转及振动信息，用以研究性质的变化和参数的化学动力学模型的获取。
Fortebio Octet 生物膜干涉技术(BLI)常见问题解答-第二版
生物膜干涉技术(BLI) 常见问题解答（第二版）目录缩写说明 (2)动力学相关术语 (2)传感器和仪器相关术语 (2)生化相关术语 (3)1 实验基本常识 (3)1.1如何自学 (3)1.2关于动力学 (3)1.3关于耗材与样品要求 (5)1.4关于生物膜干涉技术 (7)1.5软件与硬件性能参数 (8)1.6关于应用 (11)1.7关于基本操作 (11)2 动力学实验设计与操作 (15)2.1 关于固化和传感器的选择 (15)2.2 关于结合和解离 (19)2.3 关于传感器再生 (20)2.4 小分子检测 (21)2.5 动力学实验操作 (23)2.6 动力学实验数据处理 (29)2.7实验常见问题（动力学部分） (39)3 定量实验设计与操作 (44)3.1定量实验设计 (44)3.2 定量实验操作 (46)3.3定量实验数据处理 (48)3.4实验常见问题（定量部分） (51)4 仪器维护与硬件问题 (51)5 联系我们 (55)缩写说明动力学相关术语k on或k a：结合速率常数，单位M-1s-1k off或者k d：解离速率常数，单位s-1K D：亲和力常数（解离平衡常数），单位Mk obs：表观结合常数[C]：分析物浓度Ligand：配体，即固化在传感器上的物质Analyte：分析物，即与固化物质结合的物质R max：理论上分析物结合信号的最大值，即所有ligand均被analyte结合后所获得的信号Req：分析物结合达到平衡时的信号值Initial slope：起始斜率BLI：生物膜干涉技术Baseline：平衡步骤Association：结合步骤Dissociation：解离步骤Loading：固化步骤传感器和仪器相关术语SA：链霉亲和素传感器SSA：超级链霉亲和素传感器APS：氨基丙基硅烷传感器AR2G：氨基偶联传感器AHC：抗人免疫球蛋白Fc段传感器AHQ：人免疫球蛋白定量传感器AMQ：鼠免疫球蛋白定量传感器AMC：抗鼠免疫球蛋白Fc段传感器NTA：镍离子传感器anti-His：抗组氨酸标签传感器anti-GST：抗GST标签传感器Capture类传感器：除去SA，SAX，SSA，AR2G，APS外的传感器Octet：Octet家族仪器，包含Octet RED，RED96，QK，QKe，QK384，RED384，HTX，K2RED系列仪器：RED，RED96，RED384，K2QK系列仪器：QK，QKe，QK384生化相关术语EDC：1-(3-二甲基氨丙基) -3-乙基-碳化二亚胺NHS：N-羟基琥珀酰亚胺HRP：辣根过氧化物酶DAB：二氨基联苯胺，一种HRP的底物，在HRP催化后可以生成金属沉淀EMSA：电泳迁移率实验，用来研究DNA和蛋白的结合Epitope binning：表位分析His-tag：组氨酸标签Co-IP：免疫共沉淀PBS：磷酸盐缓冲液BSA：牛血清白蛋白hIgG：人免疫球蛋白mIgG：鼠免疫球蛋白1:1反应：一份的ligand与一份的analyte形成一份的产物，即两者只有一个结合位点2:1反应：Ligand上有2个可以和analyte的结合位点，并且两者独立1:2反应：Analyte上有2个可以和ligand结合的位点，并且两者独立1 实验基本常识1.2关于动力学1.2.1 k on, k off, K D值各代表什么意义？生物分子间的相互作用一般视为可逆反应。
oct检测原理
Oct检测，全称为Octet Multiplexing Technology，是一种先进的生物分子相互作用分析技术。
它通过测量生物分子之间相互作用的强度和频率，来获取关于这些分子的信息。
这种技术在生物科学、药物研发、环境监测等领域有着广泛的应用。
Oct检测的基本原理是利用生物分子之间的特异性相互作用，通过改变溶液中的条件（如温度、pH值、离子浓度等），使得这些相互作用发生变化，从而影响到生物分子的运动状态。
然后，通过测量这些变化，就可以得到关于生物分子的信息。
Oct检测的具体步骤如下：1. 首先，将待测的生物分子固定在一个微小的颗粒上，这个颗粒被称为“Octet”。
2. 然后，将这个Octet放入到一个充满溶液的容器中。
在这个容器中，生物分子可以自由地运动。
3. 接着，通过改变溶液中的条件，使得生物分子与Octet之间的相互作用发生变化。
这种变化可以通过测量Octet在水中的沉降速度来反映。
4. 最后，通过对这些数据的分析，就可以得到关于生物分子的信息。
例如，如果生物分子与Octet之间的相互作用增强，那么Octet的沉降速度就会变慢；反之，如果这种相互作用减弱，那么Octet的沉降速度就会变快。
Oct检测的优点主要有以下几点：1. 高灵敏度：Oct检测可以检测到非常微弱的生物分子相互作用，这使得它在研究一些难以检测的生物过程时具有很大的优势。
2. 高分辨率：Oct检测可以区分出不同的生物分子，这使得它在研究复杂的生物系统时具有很大的优势。
3. 实时性：Oct检测可以在非常短的时间内得到结果，这使得它在需要快速反应的应用中具有很大的优势。
4. 无标记：Oct检测不需要对生物分子进行任何化学修饰，这使得它在研究活体细胞时具有很大的优势。
总的来说，Oct检测是一种非常强大的生物分子相互作用分析技术，它的出现极大地推动了生物科学的发展。
最新的分子间相互作用分析仪MST
蛋白来发光(NT.115 系统)，也可以用色氨酸自发荧光来检测(belFree 系统)。 荧光分子或颗粒最初是自由均匀分布的。在红外激光照射下，分子收到热泳动的作用力，而移出加热区域，最后分
子在热泳动作用力和质量扩散作用力下达到平衡，形成稳定态。在关闭激光后，分子扩散重建均匀分布状态。下图显示 了该过程。
您可以测量 sub-nM 到 mM 间的亲和力 belFree: 测量内在荧光 您不需要经过标记步骤，因而能测量一些对标记过程敏感的蛋白，如跨膜受体 该系统非常敏感，甚至能检测靶标分子微小的基团的修饰 该系统能精确测量各种结合物，包括极弱甚至无内在荧光的分子，如核酸、糖、多数小分子和很多蛋白 您可以测量 10nM 到 mM 间的亲和力
主要特点： NanoTemper 独特的 MST 技术，可应用于： ☆ 直接在生物溶液环境中测量任何（生物）分子间亲和力(KD, 解离常数) ☆ 研究血清、细胞裂解液或其它生物溶液对生物分子的作用，并且能够分离出真正的结合过 ☆ 直接在细胞膜上研究膜结合蛋白 ☆ 研究溶液中酶活性、复合物形成、定向组装过程的多组分反应或者生化成分 ☆ 使用荧光标记竞争物以无标记的方式获得更大的筛选项目 (“竞争性 MST” ) ☆ 一个靶标上不同结合位点的区分 ☆ 研究酶动力学(vmax, kcat) ☆ 研究化学计量学并确定生物分子结合位点的数目 ☆ 研究结合能量学 ΔG (自由能 ), ΔH (焓) and ΔS (熵) ☆ 直接测量或是在竞争性实验中研究抑制物亲和力 Ki ☆ 这个方向是 MST 最常用的应用，一个结合物浓度固定，另一个梯度变化…不同于直接相互作用，这写实验中 的荧光信号是被竞争物挤下来的分子发出的，用于研究竞争性结合物的结合能力…该研究使用与确定靶分子上的配体结 合位点…该研究用于测定反应中的热力学参数，包括焓和熵… 应用说明： ☆ 直接相互作用 ☆ 竞争性相互作用
PLEXERA生物分子相互作用仪操作规程
PLEXERA生物分子相互作用仪（SPR-i）操作规程开机，先开电脑，再开SPRi，关机相反。
测试前准备：检查regenerant(甘胺酸,PH=2,10mM), buffer（PBS-T 0.05%T），封闭液Blocking(乙醇胺)样品制作在制样品中完成，压5-10分钟左右，完成后检查是否有气泡，检查两个小洞是否被堵。
上样前要进行3次Initial Prime, 2次regenerant Prime, 1次Initial Prime.上样时，先把芯片背面用丙酮擦拭干净，后要把芯片往里推到位，装进后要反扣下来。
加折射油：折射率匹配油要滴在正中央，在接触折射油的瞬间压下去。
正式测试及参数设置：1.启动PLEXERA INSTRUMENT CONTROL SOFTW ARE在INSTRUMENT SETUP中设置FLOW CELL（25）度和96孔板温度，打开H2O/BUFFER DEGASSER=ON WATER SENSOR=OFF(已经坏了)；确认重生，缓冲，及废液正常。
2.点LOAD INSTRUMENT1》如果有旧芯片，可以用它来做维护。
PRIME是对系统进行冲洗并保证系统缓冲溶液均一性，并扣除可能气泡。
一般重复3次。
2》load reagents,查检输液管对应试剂瓶溶液，PRIME 2次3》用酒精轻轻擦拭棱镜和实验芯片背面。
加折射油，装芯片。
4》load＆ｐｒｉｍｅｆｌｏｗｃｅｌｌ，ｆｌｏｗｒａｔｅ设为30 ul, Duration 60sec, 使CELL中冲满溶液。
3.运行PRIME SYSTEM一次，准备完毕。
实验方案设计：(一)WIZARD 2ml(PE)是BIG1-BIG6; 1ml管是SMALL1-SMALL2, 96孔板是A1-H12.(二)根据样品量，一般为700ml左右，设置流速与时间，一般REEAGENT,选择3X300，后把时间设定到当前。
(三)改变LOCATION 一般把A12改为BIG6. FLOW RATE 改为2，ASSOCIATION/DISSOCIATION DURATION都改为300，再依次改INITIAL BASELINE…; BASELINESTABILIZATION BEFORE..,再改REGENERATAFTER …,选择FIRST REGEN SOLUTION=REG.1.POST-RUN 过夜时候使用，让系统慢慢流动。
Fortebio Octet BLI 蛋白生物素标记应用指南
蛋白的生物素标记操作指南（Octet分子互作仪器测定专用）概述链霉亲和素与生物素之间的相互作用是目前已知强度最高的非共价作用，并且二者的结合稳定性好，专一性强，不受试剂浓度，pH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。
因此，链霉亲和素与生物素快速，稳定和不可逆非共价的结合被广泛应用于研究生物分子间的相互作用。
Octet平台的链霉亲和素（SA/SAX/SSA）生物传感器已被开发用于蛋白定量和动力学，结合在SA//SAX/SSA传感器上的第一个蛋白质必须进行生物素化标记。
为方便利用Octet平台上的SA/SAX/SSA传感器进行动力学和定量分析，特制订本指南为利用生物素化试剂标记目标蛋白提供指导。
生物素试剂的选择Biotin为例。
生物素化试剂建议购买小包装，使用DMSO溶解配制成10 mM母液保存于-20℃备用。
产品货号：21312的NHS-PEG12-Biotin为例：10 mM母液的配制案例=（生物素化试剂质量1mg）÷（生物素分子量941 Da）×100=0.106 mL，1 mg生物素化试剂溶于0.106 mL DMSO中即为10 mM母液。
氨基偶联生物素化试剂反应示意图实验试剂和耗材1)缓冲液：DMSO，1×PBS，PBST（PBS+0.02% tween20）2)掌上离心机，一台3)生物素标记试剂EZ-Link NHS-PEG12-Biotin (Thermo，货号：21312) 1 mg，加入0.106 mL的DMSO配置成10 mM母液4)PD Min iTrap™ G-25 Desalting Column用于脱盐，蛋白样品体积0.1-0.5 mL，(GE, 货号：28-9180-07 )。
5)Zeba desalting spin columns脱盐柱：a)蛋白样品体积30-130 uL,使用0.5 mL脱盐柱(Thermo, 货号：89882)b)蛋白样品体积200-700 uL,使用2 mL脱盐柱(Thermo, 货号：89889)c)蛋白样品体积600-2000 uL,使用5 mL脱盐柱(Thermo, 货号：89891)6)透析装置：Slide-A-Lyzer™ Dialysis Cassettes（Thermo，具体型号根据目标蛋白样品体积以及目标蛋白的分子量进行选择。
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根据实验步骤设定将传感器在样品板的 不同位置移动
生物膜光干涉技术Bio-Layer Interferometry (BLI)
当生物分子结合到传感器表面就形成了一层生物膜 生物膜对透过传感器的光的波形造成干涉现象 干涉现象以相位移动的方式被检测，从而可以检测结合 到传感器分子数量的变化
生物分子结合动力学
Affinity range (approximate) Sample Usage Temperature Control 21 CFR Part 11 Compliance
0.1 mM to 0.1 mM to 1 mM to 0.1 nM 0.1 nM 10 pM Non-destructive and recoverable 4°C above ambient to 40°C
Octet系统可提供的数据
亲和力测定
• Binding KD • On and off rates • Rank order
结合特异性
• Yes / No kinetic screening • Epitope binning / mapping
蛋白质浓度定量（混合物）
• Picogram to milligram dynamic range • Contaminant testing
Dip and Read Immunogenicity Kit Dip and Read Residual Protein A Detection Kit
Yes Yes Yes Yes Yes
No No
Kits
可以根据用户的应用设计传感器
为目前种类最多的供应商
传感器可再生使用
ADA ID Mab #2 Cycle # 1 nm Shift 0.7049
Mab #2
2
3 4 5 6 7 8 9 10
0.7435
0.7431 0.7822 0.7702 0.6712 0.7221 0.7654 0.7515 0.7729
Regeneration solution = 1mM HCl
Avg. nm Shift StDev %CV 0.7427 0.0346 4.7%
Test Samples
Time (sec)
120
•
• • •
利用标准品在不同浓度时结合速率的 差异来定量样品的浓度 15-30分钟可以分析各样品 标准曲线可以重复使用 病毒颗粒等其他样品也可定量
Binding Rate
Concentration
Octet 软件
• 可灵活输出各种格式， Excel表，JEPG格式等 • 动力学分析直接得到ka, kd and KD 结果 • 浓度分析直接得到，ug/ml, ng/ml等浓度计算 结果
Octet 产品简介
Octet Instruments • 5种型号 - Octet QK, Octet Qke, Octet RED, Octet QK384, Octet RED 384 • 使用通用的样品板(96 and 384 well) • 没有流路系统 • 样品经过检测后，仍然留在原处，可以回收再使用 Biosensors • 浸入样品即检测，1至16个样品可以同时检测 • 10种传感器可供选择，分析不同种类的样品 • 传感器为抛弃式设计，既可以检测共价键结合的样品 也可以再生使用 Software and computer • 常用实验方法已经预制在模板中 • 不需要单独购买软件 Validation options • 经过验证, 提供IQOQ服务, 符合美国FDA CFR Part 11 标准
Binding (nm)
Association
Dissociation
Time
• • • •
8-16 个样品可以被同时平行检测 检测数据被事实记录 实验方法可根据用户的要求来设计 动力学和亲和力由软件分析得到
Octet RED进行蛋白质浓度测定的工作流程
Octet Biosensors Standards Binding (nm)
Octet RED96
> 150 D 2, 5, or 10 Hz 8 1-8 1 Yes No 96 180 µL per well
Octet RED384
> 150 D 2, 5, or 10 Hz 16 1 - 16 2 Yes Yes 96 / 96HA 384 / 384TW 40 µL per well
兼容96孔板和384孔板 • 更高的通量,更少的样品消耗 • 最小体积只要40ul 16通道同时检测，让所需 实验时间更短 两个样品板位置 • 更多的实验方案 • 一次连续分析更多样品 全自动化解决方案 • 可与多种液体工作站连接
Octet 全自动功能
• Automated door and plate stage • Works with articulated arm and track-style robotic systems • Plate stage presents the biosensor tray, sample and reagent plates for robot • Octet software has automation hooks enabled to interact with robot software
• 更宽的应用范围
• • • • 直接检测粗制的样品，甚至是样品中存在不溶解的成分 耐受各种溶液环境，只有结合到传感器表面的分子才会被检测 病毒颗粒等大分子样品也能得到动力学结果 检测共价键结合的样品
• 更低使用和维护的成本
• 相对其他的非标记检测系统，耗材的成本低 • 系统稳定，未来的使用和维护成本也低
Octet QKe
> 5000 D 0.3 Hz or 0.6 Hz 1 1-8 1 Yes No 96, 96 HA 80 µL per well
Octet QK384
> 5000 D 0.3 Hz or 0.6 Hz 2 1 - 16 2 Yes Yes 96 / 96HA 384 / 384TW 40 µL per well
Available as option for all systems
96 HA 384 TW 96 well microplate with half-area well size ForteBio 384 tilted-well microplate
1 mM to 10 pM
Octet 384 系统的优点
For simple 1:1 binding: Ab + Ag
ka
kd
Complex
ka = rate of association or “on-rate”
kd = rate of disassociation or “off-rate”
Non-linear curve fit of data
军事医学科学院 2台 Novo Nordisc中国研发中心 中国生物制品药品检定所 神州细胞工程有限公司 中科院武汉病毒所 厦门大学 天津商业大学 上海药明康德新药开发有限公司 GSK中国研发中心 Novartis中国研发中心 上海旭华生物科技有限公司 江苏太平洋美诺克生物药业有限公司 江苏泰康生物医药有限公司
Y = Y0 + A (1 - e-kobs*t) KD =
Y=Y0+Ae-kd*t kd ka
ka=
kobs – kd
[Conc Ag (M)]
Octet 系统测定动力学的工作流程
Baseline Baseline Loading
Octet Biosensors
Buffer Ligand-Biotin Protein of Interest
Octet 系统和特点
Octet 系统的优点
• 更高的通量, 更快的实验流程
• 8-16个样品同时检测，是非标记技术中通量最高的 • 15-30分钟可以完成96个样品的分析
• 没有溶液控制系统，不需要清洗和维护流路，直接开始读取数据
• 操作简单
• 适应多用户的情况，经过半天的培训就可以操作和使用 • 不需要特别优化实验条件，传感器是抛弃式的
– SDi 2010 Market Report survey – 成长最快速的非标记技术公司
• 公司发展的远景：成为每个实验室都能拥有的分子互作 系统
专业的服务
•在中国有2名硬件工程师，3名应用工程师 •除了提供批量生产的生物传感器以外， 还可以为用户定制传感器 •提供实验方法开发和优化服务
国内用户名单
实时检测，非标记的 生物分子互作检测平台
Octet 可分析多种生物分子间的相互作用
Size
1000 nm 200 nm 75 nm
MW
Cells Bacteria Virus IgM IgA
1,000,000
Bacteria Virus Antibody - Antigen Receptor - Ligand DNA - DNA
Octet System Specifications
Octet QK
Molecular Weight Range Data Acquisition Rate # Spectrometers # Channels per Read Microplate Positions Biosensor Reracking Robot Compatible Microplate Formats Minimum Sample Volume > 10,000 D 0.6 Hz 1 1-8 1 No No 96, 96 HA 80 µL per well 0.1 mM to 0.1 nM
Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2 Mab #2