real time PCR 数据分析excel模板
新冠核酸检测PCR性能验证表格
验证目的：试剂厂家：试剂名称：医疗器械注册证编号:试剂批号：扩增仪器：仪器编号：验证参考文献：验证指标：一、符合率验证验证方案：要求：阴性样本：阳性样本：XXX医院XXX科新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）性能验证报告新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测程序常规应用前，对经确认的符合预期用途的检验程序进行验证，保证检验质量，满足临床需要CNAS-GL039 分子诊断检验程序性能验证指南符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应选取阴性样本 5 例，阳性样本 10 例，采用参比方法和候选方法平行检测，将所有检测结果按下表汇总填表，计算符合率相关符合率应不低于试剂说明书声明新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）ABI7500PCR实时荧光定量PCR仪5例正常人鼻咽拭子样本3例窒间质评阳性样本，3例不同稀释度阳性参考品二、检出限验证验证方案：要求：标准物质浓度：稀释液：稀释浓度：厂家声明检出限：三、抗干扰能力验证验证方案：要求：干扰物质1：加入量：生理盐水200copies/mL5次结果均为阳性，检出率100%使用定值标准物质（如：国际参考品、国家参考品、厂家参考品），梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，重复测定 5 次根据临床需求及实际情况，选取相应干扰物质，适量加入到待测弱阳性样本中，按常规样本操作流程，重复测定 3 次3次检测结果均为阳性，验证通过人全血0.5ml干扰物质2：加入量：四、交叉反应验证验证方案：要求：加入病原体1：加入病原体2：验证日期：操作者：复核者原始数据保存位置：原始数据文件名：原始数据附图：XX鼻腔喷雾剂0.2ml乙型流感病毒取一定浓度与新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸可能存在交叉反应的病原体加入样本保存液或经确认为阴性的样本中，按常规样本操作流程，重复测定3次3次检测结果均为阴性，验证通过SARS 冠状病毒。
real time PCR 数据分析
real time PCR 数据分析real-timepcr数据分析无论所使用的real-timepcr是何种型号，正确的数据分析对于获得有效的实验结果都是至关重要的。
这里介绍有关real-timepcr数据分析的知识。
在探讨基本分析过程之前，先了解如何设计一个不好的实验。
如果你就是自己设计的引物和探针，那有利于下一步的工作。
但是在有些情况下，人们采用出版发行文献上的序列可以更便利。
忘记，即便就是出版物提供更多的序列也无法确保可以获得优化的实验结果。
而且排印错误的可能性也须要考量在内。
所以步入实验室之前采用blast对全部序列展开核实保证他们就是恰当的。
下订单前先检察引物和探针的序列和tm值就是实验设计的基本建议。
标准曲线是判断实验质量的重要手段。
使用一个已知的模板，pcr产物，合成的寡核苷酸或转录的rna做个标准曲线能够确定pcr的效率，敏感性，动态范围和其他的参数。
建立标准曲线时使用od260的模板样本。
模板的总量以dna分子的数量来描述，把质量转化为dna含量的公式如下：（质量（克）*阿伏伽德罗常数）每个碱基的平均值质量*模板的长度。
例如，合成70-mer的单链dna，样本质量为0.8*10?-11gm。
代入公式得：（0.8*10?-11*6.023*10?23molecules/mole）330gm/mole/base*70base。
如果使用双链的模板，则碱基的平均质量为660gm/mole/base。
标准曲线采用的模板含量从1*10?7已经开始已连续吸收7次每次吸收10倍，最终获得10个模板拷贝。
这样的浓度有利于获得最低的δrn和最高的ct。
用excel画曲线时以模板数量的对数值为x，ct（cyclethreshold）值y轴。
标准曲线的计算公式如下：y=mx+b。
y就是ct，m是斜率，x=log10templateamount，b=y-intercept。
用斜率排序出来实验效率efficiency【10?（-1/斜率）】-1。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
PCR室内质控数据图Excel
为失控限
且小于累积变异系数9.83%,本月质控数据较为集中且稳定，所以变异系数小.描点数据有正有负，接上月分析，无趋势。
质控负责人： 室主管： 主任： 备注： 1.用结果的对数值来计算标准差和变异系数 2.描点值的计算公式为（结果的对数值-累积质控均值）/累积标准差，以±2SD为告警限，±3SD为失控线
表格编号：CCL-ZYT-FZSW-023-01 靶值 2.14E+03 试剂厂家 达安基因 试剂批号 2013004 质控名称 HBV临界值质控 质控批号 2012004 质控来源 自制血清 9.94% 累积均值 3.22 累积标准差 0.32 累积变异系数 起止日期 2013年11月1日至2013年11月30日 日期 结果 对数值 描点值 低值HBV-DNA室内质控图 3 11.1 8.65E+03 3.94 2.24 11.2 #NUM! #NUM! 2 11.3 #NUM! #NUM! 1 11.5 #NUM! #NUM! 标 标 0 准 准 11.6 #NUM! #NUM! 差 差 1 0 22 2 23 3 2 4334 5 4 5 64 3 76 5 5 8 7 49 6 8 610 7 11 9 7 5 12 10 8 13 8 11 14 9 12 6 9 10 15 13 16 10 717 14 11 18 15 11 12 19 81620 1213 17 21 13 9 22 18 14 23 19 14 15 24 10 2025 15 16 21 26 22 16 27 11 17 1 11.7 #NUM! #NUM! -1 11.8 #NUM! #NUM! -2 11.12 #NUM! #NUM! 次数 -3 次数 11.13 #NUM! #NUM! 11.14 #NUM! #NUM! 12S 11.15 #NUM! #NUM! 质控规则： 为告警限 11.19 #NUM! #NUM! 11.19 #NUM! #NUM! 当连续10次检测值在均值的同一测时为失控。 11.20 #NUM! #NUM! 本月标准差： #NUM! 11.21 #NUM! #NUM! 本月均值： #NUM! 11.22 #NUM! #NUM! 本月变异系数： 7.26% 11.23 #NUM! #NUM! 11.26 #NUM! #NUM! 11.27 #NUM! #NUM! 11.28 #NUM! #NUM! 11.28 #NUM! #NUM! 11.30 #NUM! #NUM! 评价： 本月共有19个质控点，其中19个点在2SD之内，占100%，本月无失控点。本月变异系数7.26%与上月8.6%相比较小，
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
Real-timePCR实验原理与技术
实时荧光定量PCR技术原理
01
在实时荧光定量PCR反应中， DNA模板被扩增时，与荧光探 针结合，产生荧光信号。
02
随着DNA的扩增，荧光信号逐 渐增强，通过对荧光信号的实 时监测和分析，可以计算出 DNA的起始浓度。
03
通过标准曲线或内参基因的校 准，可以将起始浓度转化为目 标基因的表达量或基因拷贝数 。
实时监测荧光信号
实时监测荧光信号，确保PCR产物在指数扩增阶段被检测到。
标准化实验流程
建立标准化实验流程，确保实验结果的可靠性和可重复性。
未来展望
新技术应用
01
随着新技术的不断发展，如数字PCR、微流控PCR等，Real-
time PCR技术将得到进一步优化。
高通量检测
02
通过多重PCR和高通量检测平台，实现大规模样本的快速检测。
03
Real-time PCR 实验数 据分析
数据收集与整理
数据收集
在实时PCR实验中，数据收集通常涉 及记录每个循环的荧光信号强度。这 些数据通常以图表形式表示，其中横 轴表示循环数，纵轴表示荧光信号强 度。
数据整理
收集到的原始数据需要经过整理，包 括去噪、去除异常值和标准化等步骤， 以确保数据分析的准确性。
自动化与智能化
03
实现Real-time PCR的自动化和智能化，提高实验效率，减少人
为误差。
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real-timepcr实验原 理与技术
contents
目录
• Real-time PCR 实验原理 • Real-time PCR 实验技术 • Real-time PCR 实验数据分析 • Real-time PCR 实验应用 • Real-time PCR 实验注意事项与优化建
罗氏realtime PCR操作指南(Roche LightCycler480)
LightCycler ® 480 系统快速操作指南1 一．配制好反应体系，封好膜。
接通LC480与电脑电源，电脑帐号operator ，密码LC480，点击LC480软件，登录帐号user ，密码Master1。
二．开始实验：点击，在列表中选择对应的程序，如H1N1或HBV ，点击窗口右下角的，点击软件界面右下角的，输入实验文件名点击窗口右下角的开始实验。
三．编辑子集：点击subset editor ，点击左下角的，按ctrl 键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击应用。
注意，一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验（如H1N1、HIV 与HCV ），那么可以分别设置多个子集设置样品：先在subset 中选择本次实验的子集，点击左上角的，样品输入样品名，再选择标准品类型和浓度或者阳性对照/阴性对照四．数据分析：实验运行完成后进入，选择Abs Quant/Fit Ppoint ，在窗口中的Subset （第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的，在Noise Band 中调节noise band 高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。
再点击进入，点击软件界面中间偏右的再点击软件界面左下角的值或浓度值等以及平均值标准误等信息，该部分可以鼠标拖动滑块或鼠标拖曳、鼠标点击软件右上角的为本次分析命名，如输入H1N1或其它名称五．报告输出打印：点击软件右侧的保存当前实验的分析结果，再点击软件左侧的，点击软件中部左侧的detailed 选择需要输出的分析结果，如H1N1， 分析中建议选择results 或standard curve ，点击软件界面左下方的，生成PDF 报告，如装了打印机，直接点击软件中间上方的，或者点击，选择pdf 文件保存位置后点击save 保存。
RealTimePCR结果分析与实验设计
RealTimePCR结果分析与实验设计做Real Time PCR的大体有四个目的。
1. 检测某个基因表达水平的上调或下调。
2. 检测siRNA靶基因的下调量。
3. 观测某个基因在一系列细胞中的表达模式。
4. 别出心裁的实验设计。
四种实验对应的数据处理方法是不同的。
但原理是一样的，即都基于这个公式：Ct = -k * log2（X0） + b （1）其中k=1/log2(1+E)，其中E代表PCR的扩增效率，如每个循环扩增的原DNA的90%，则E=0.9。
b是个无关紧要的常量，除非是绝对定量rt PCR，否则是用不到b的。
所谓的2 delta方法是这样的：如有基因A，内参基因C，样品甲和乙。
欲知基因A在甲中的表达量相对于乙是上调还是下调，上调或下调了多少。
应得到四个Ct值：Ct（甲A），Ct（甲C），Ct（乙A）和Ct （乙C）。
ΔCt（甲）=Ct（甲C）-Ct（甲A）=k*log2[X（甲A）/X（甲C）]ΔCt（乙）=Ct（乙C）-Ct（乙A）=k*log2[X（乙A）/X（乙C）]ΔΔCt=ΔCt（甲）-ΔCt（乙）=k*log2[A在甲中的表达量/A在乙中的表达量]如此则：R=A在甲中的表达量/A在乙中的表达量=2^（ΔΔCt/k）这样一来，只要知道k值就可以了。
k=1/log2(1+E)，如果扩增效率是100%，则E=1，k=1。
否则只要做个浓度梯度，就可把它计算出来。
1. 做siRNA时，R<1，（1-R）*100%即siRNA下调靶基因的量。
2. 表达模式分析只要一个delta就行了。
3. 一通百通，无论怎么弄，都有解决办法。
实验设计时，每板重复三次，做三个板，是为了消除PCR本身和样品本身的误差，是必不可少的。
如同微阵列一样，三次是最少次数。
取平均值可以，中数也可以。
无论如何,实验设计一定要严谨。