第十章-植物种质的超低温保存PPT课件
合集下载
(种子学课件)种子超低温贮藏
种子含水量超过HMFL，冷冻到一定 温度，种子死亡。例如，小麦种子含水 量高于26．8％，冷冻到-7℃则发芽率下 降到25％(表2)。根据试验，小麦种子含 水 量 为 5.7 ％ ～ 16.4 ％ ， 在 液 氮 温 度 (196℃) 冷 冻 保 存 24 个 月 之 后 发 芽 率 仍 在 92%～96%，同对照相比没有明显差异。
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
种子超低温贮藏【优质】PPT文档
甘油、PEG等，使用冷冻保护剂的量应是足够到有冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。
5.解冻后的发芽方法：液氮保存顽拗型种子难以成功，可能
与保存后的发芽方法不当有关，致使还有生活力的种子在发芽过程 中受损伤或死亡。
超低温贮藏的应用
LOGO
u极大地延长储藏种子的寿命， 而不产生遗传变异
从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物 种的作用。（例如红豆杉）
❖ 对于含水量高的种子, 可以采用组织培养与超低 种子超低温贮藏是指利用液态氮(-196℃)为冷源，将种子等生物材 料置于超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢活动处于基本停止状
态，而达到长期保持（种子）寿命的贮藏方法。 科学的贮藏方法可以使种子寿命延长、生活力旺盛, 并且能保证作物出苗早、整齐、健壮; 但是如果贮藏方法不合理, 则种子易霉烂、变 质, 生活力降低, 播种后易造成缺苗、断垄, 给农户带来惨重的损失。 从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物种的作用。
u安全地保存许多植物的花粉、分生组织、芽、愈伤组织和细 胞等。 u利用液氮超低温保存花粉
已经在作物、蔬菜( 包括西甜瓜) 、果树 、花卉苗木、茶树、药材等植物上取得了
一定的进展。 利用液氮超低温保存花粉的一般程序是: 花粉采集→ 花粉干燥→花粉低温预处理→
❖ 超干贮藏 适合于长期保存珍贵稀有种质
在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 2、外在因素对种子对液氮反应的影响 液氮保存的种子不需要特别干燥，能省去种子的活力监测和繁殖更新，是一种省事、省工、省费用的种子低温保存新技术。
5.解冻后的发芽方法：液氮保存顽拗型种子难以成功，可能
与保存后的发芽方法不当有关，致使还有生活力的种子在发芽过程 中受损伤或死亡。
超低温贮藏的应用
LOGO
u极大地延长储藏种子的寿命， 而不产生遗传变异
从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物 种的作用。（例如红豆杉）
❖ 对于含水量高的种子, 可以采用组织培养与超低 种子超低温贮藏是指利用液态氮(-196℃)为冷源，将种子等生物材 料置于超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢活动处于基本停止状
态，而达到长期保持（种子）寿命的贮藏方法。 科学的贮藏方法可以使种子寿命延长、生活力旺盛, 并且能保证作物出苗早、整齐、健壮; 但是如果贮藏方法不合理, 则种子易霉烂、变 质, 生活力降低, 播种后易造成缺苗、断垄, 给农户带来惨重的损失。 从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物种的作用。
u安全地保存许多植物的花粉、分生组织、芽、愈伤组织和细 胞等。 u利用液氮超低温保存花粉
已经在作物、蔬菜( 包括西甜瓜) 、果树 、花卉苗木、茶树、药材等植物上取得了
一定的进展。 利用液氮超低温保存花粉的一般程序是: 花粉采集→ 花粉干燥→花粉低温预处理→
❖ 超干贮藏 适合于长期保存珍贵稀有种质
在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 2、外在因素对种子对液氮反应的影响 液氮保存的种子不需要特别干燥，能省去种子的活力监测和繁殖更新，是一种省事、省工、省费用的种子低温保存新技术。
植物细胞组织和器官超低温保存
低温保存是种质资源短期和中期保存常用的方法。
主要适用再生植株、分生组织培养物的保存
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2. 干燥保存
将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适 宜的低温下，可成功保存种质。 （1）预处理：将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高，预处理 12-20d。 （2）干燥：包括胶囊化处理（encapasulation treatment） 和脱水处理（desiccation treatment）等方法。 （3）储藏：通常选用0℃以上低温，或室温储藏。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰 晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻 保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰 点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低 未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损 伤，细胞得以在超低温条件下保存。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
一、限制生长保存
限制生长保存（restricting conservation）是指改 变培养物生长的外界环境条件，限制离体保存材料 的生长速度，使细胞生长降至最小限度，但不死亡， 从而达到延长继代培养时间的目的。
目前使用较多的限制细胞生长的措施有改变培养 环境（如降低培养温度、减少培养瓶内氧气含量、 减少光照等）、提高培养基渗透压、加入生长抑制 剂、饥饿法、失水干燥保存等。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的 液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不 适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的 条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0. 1-10℃的降 温速度(一般1~2℃／分较好)。降到-70℃左右，随 即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196℃。在 这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时 间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少 到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结 冰。该方法适用于成熟含有大液泡和含水量高的细 胞。
植物种质的超低温保存
在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。
a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差 异 b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达到抑制 作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不 同。 c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则 可能无效。
实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃 薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二 甲基氨基琥珀酰胺酸（B9）、矮壮素（CCC）可以使葡萄试 管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与 一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。
d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻 存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切 取时对材料的伤害。 e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬 季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬 季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以 动机去才有较高的存活率
10.2.2材料的预处理
预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是 减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼， 以有效提高组织活细胞的抗冻能力。 •在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些 可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱 落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（DMSO）等，最 常用的方法是增加培培养基中蔗糖的浓度。
• （1）种子保存 目前常用的种质保存方法有以下几类： 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长期保存是防止良种衰变的一条重 要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降， 而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。
•
10.2.3.2保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里， 或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细 胞的渗透冲击，保护剂应在30~60min内逐 渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于 DMSO有一定毒性，所以预处理应该在0℃ 左右的低温下进行。处理时间也不能过长， 一般不宜超过1h。
(种子学课件)种子超低温贮藏
种子含水量超过HMFL，冷冻到一定 温度，种子死亡。例如，小麦种子含水 量高于26．8％，冷冻到-7℃则发芽率下 降到25％(表2)。根据试验，小麦种子含 水 量 为 5.7 ％ ～ 16.4 ％ ， 在 液 氮 温 度 (196℃) 冷 冻 保 存 24 个 月 之 后 发 芽 率 仍 在 92%～96%，同对照相比没有明显差异。
二、不同种类种子对液氮低温反应的差异
根据种子对液氮低温的反应，将种 子分为三种类型(Stanwood，1985)：①忍 耐 干 燥 又 忍 耐 液 氮 的 种 子 (desiccationtolerant LN2-tolerant seed)；②忍耐干燥对 液氮敏感的种子(desiccation-tolerant LN2sensitive seed)'③对干燥和液氮均敏感的 种 子 (desiccation-sensitive LN2-sensitive seed)。
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率（石思信等，1985）
适 合 于 冷 冻 保 存 的 最 高 含 水 量 (high moisture freezing limits，HMFL)就是种子 含水量的临界值。在同一植物种中这个
二、不同种类种子对液氮低温反应的差异
根据种子对液氮低温的反应，将种 子分为三种类型(Stanwood，1985)：①忍 耐 干 燥 又 忍 耐 液 氮 的 种 子 (desiccationtolerant LN2-tolerant seed)；②忍耐干燥对 液氮敏感的种子(desiccation-tolerant LN2sensitive seed)'③对干燥和液氮均敏感的 种 子 (desiccation-sensitive LN2-sensitive seed)。
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率（石思信等，1985）
适 合 于 冷 冻 保 存 的 最 高 含 水 量 (high moisture freezing limits，HMFL)就是种子 含水量的临界值。在同一植物种中这个
植物种质资源的保存
h
9
三、保存方式的利弊
1、 原生境保存和异地保存
弊：需耗费巨大的人力、物力和土地，在实际中很难实施， 而且易受自然灾害、虫害和病害的侵袭，造成植物资源 的丧失。
2、 种质库（种子）保存
弊：1）生活力随储存期的延长逐渐丧失；2）无性繁殖的
植物（如苹果、柑橘等）难于采用种子保存；3）采用
无性繁殖来保持其优良性状的植物（许多果树），用种
第十章 植物种质资源的离体保
存
h
1
概述
一、定义
➢ 植物种质资源（又称品种资源、遗传资源或基因资源）
是指携带各种不同遗传物质的植物总称，包括栽培，野 生及人工创造的各种植物的品种或品系。是生物多样性 的重要组成部分，是选育优质、高产、抗病（虫）、抗 逆新品种的物质基础，是生物技术研究取之不尽的基因 来源。
子繁殖后代会发生变异；4）顽拗型种子植物（芒果、
椰子、油棕等）因其种子不易干燥脱水和低温储藏，不
宜用种子保存或保存难度很大；5）有些植株不产生种
子，如脐橙、香蕉；6）易遭自然灾害袭击而使种质资
源丢失。
h
10
三、保存方Байду номын сангаас的利弊
3、离体保存
是将植物外植体在无菌环境下进行组织培养， 并贮存在各类生长抑制条件下，使其缓慢生长或 停止生长，以达到长期保存的目的，而在需要利 用时可迅速恢复正常生长。
来
葡
葡
萄
萄
h
23
第三节
植物物种资源的超低温保存
一、物种资源超低保存的发展概况 二、物种资源超低温保存的原理 三、超低温保存的基本程序 四、超低温保存的实例
h
24
一、物种资源超低保存的发展概况
第十章-植物种质的超低温保存PPT课件
第十章 植物种质的超低温保存
-
1
种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
-
2
种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
-
13
分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
转移温度
液氮
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等）
• 程序降温仪
-
14
分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
-
12
快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。
• 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
-
18
THE END
-
19
– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO
、蔗糖）
-
10
（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
-
1
种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
-
2
种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
-
13
分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
转移温度
液氮
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等）
• 程序降温仪
-
14
分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
-
12
快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。
• 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
-
18
THE END
-
19
– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO
、蔗糖）
-
10
（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
(种子学课件)种子超低温贮藏
2.忍耐干燥对液氮敏感的种子
许多果树和坚果类作物如李属、胡桃属、榛属
和咖啡属的植物种子属于这种类型。这类种子 多数能干燥到含水量10％以下，但是不能忍耐40℃以下的低温。例如榛子含水量可降到6％， 冷冻到0～-20℃不失去生活力。但是当温度降低 到-40℃以下种子生活力受损。忍耐干燥对液氮 敏感的种子多数含有较高的贮存类脂(如脂肪等)， 有的种含量高达60％～70％。含油量是否是引 起种子对液氮敏感的因素，尚不清楚。这类种 子的寿命一般少于5年。研究这类种子的保存技 术非常必要。因为这类种子多属于主要经济作
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
种子超低温贮藏
一、种子超低温贮藏的概念和意义
1.种子超低温贮藏的概念
种子超低温贮藏是指利用液态氮(196℃)为冷源，将种子等生物材料置于 超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢 活动处于基本停止状态，而达到长期保 持（种子）寿命的贮藏方法。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
.
12
快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。 • 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 • 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的
技术。应用前景广阔。
.
3
一、离体保存方法
• 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。
• 抑制生长的方式：
– 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法
.
4
离体种质保存的优点
.
16
玻璃化法
• 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 • 影响因素： ✓ 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； ✓ 植物材料的脱水温度和脱水时间。
.
17
（三）基本程序
• 4、化冻操作 • 快速化冻：适用于大多数材料 • 慢速化冻法：适用于含水量较低的材料 • （5、去除冰冻保护剂） • 6、化冻材料的活力检测： • 根本方法：再培养
• 占用空间少，节省人力 、物力和土地； • 便于种质资源的交流利用； • 需要时，可以利用离体培养方法很快大量
繁殖； • 避免自然灾害引起的种质丢失。
.
5
二、超低温冰冻保存技术
.
6
（一）原理
• 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、 生长都停止了，因而排除了遗传性状变异 的可能性，达到长期保存植物种质的目的 。
– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO
、蔗糖）
.
10
（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 • 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 PEG等。
.
11
（三）基本程序
• 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保 持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的 稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的• 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。
• 解决措施：
– 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；
.
13
分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
液氮
转移温度
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大
量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞
等）
• 程序降温仪
.
14
分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
.
8
（三）基本程序
• 1、材料的选择：
– 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原 生质浓厚的分生细胞或组织；
– 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活 率高）
– 大小：适宜
.
9
（三）基本程序
• 2、材料的预处理
– 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞 经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力 。
.
18
THE END
.
19
第十章 植物种质的超低温保存
.
1
种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
.
2
种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
.
15
玻璃化法
• 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。
• 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。