单克隆抗体药物的临床前研发
最新：单克隆抗体药物治疗视神经脊髓炎谱系疾病的临床试验研究进展
最新：单克隆抗体药物治疗视棉经脊髓炎谱系疾病的临床试验研究避展视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorders , NMOSD）是一种体液免疫介导的中枢禅经系统炎性脱髓鞠疾病，多累及视神经和脊髓，真高高复发、高致残的特点，主要的致病抗体为抗水通道蛋白4( A QP4）抗体。
约70%的NMOSD患者AQP4抗体阳性，女性较男性高发（9 : 1 ），平均发病年龄为40岁。
NMOSD急性期的治疗方法包括大剂量糖皮质激素、丙种球蛋白冲击治疗和血浆置换等。
经典的缓解期预防复发药物包括口服糖皮质激素、硫瞠瞟岭、他克莫司、环抱素等免疫抑制剂。
虽然这些药物仍是当前不可替代的治疗NMOSD的常用药物，但部分患者难以忍受真带来的广泛的免疫抑制、骨髓抑制等不良反应，因此开发安全高效的药物，对阜期治疗、预防复发以及提高NMOSD患者的生活质量尤为重要。
近年来，己再多种单克隆抗体药物用于治疗NMOSD 因真靶点相对明确，作用效应较集中，不良反应相对较少，为该疾病的治疗带来新希望。
为确定这些药物的中远期疗效、安全性和不良反应等，已开展了一系列临床t鹉金。
本文就单克隆抗体药物治疗NMOSD的作用机制和临床试验的最新进展进行综述。
01、NMOSD的发病机制AQP4抗体在NMOSD的发生发展中起重要作用。
AQP4是一种位于细胞膜的转运蛋白，可根据渗透压的变化控制水分子进出细胞，在整个中枢神经系统（包括脊髓、视神经和脑）的星形胶质细胞中表达。
AQP4抗体主要由外周的B细胞产生。
真在一定的条件下可通过血脑屏障（BBB）并与血管周围的星形胶质细胞足突表面的AQP4抗原结合，来诱导补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）；前者指AQP4抗体和抗原结合后激活补体经典途径，形成膜攻击复合物，对星型胶质细胞发挥裂解效应；ADCC是指AQP4抗体和抗原结合后，抗体的Fe段与杀伤细胞（NK细胞、巨睦细胞等）表面的Fe受体结合，杀伤细胞通过程放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质直接杀伤星型胶质细胞。
单克隆抗体药物研制的关键技术之一：抗体药物靶标筛选
白作 为 抗 体 药 物 靶 标 来研 发 抗 体 药 物 。 这 种 方 法 的缺
点 主 要 集 中在 两 方 面 ：一 是 所 能 得 到 的抗 体 药 物 靶标 的 数 量 极 其 有 限 ，并 且 这 些 靶 标 都 是 十 多年 前 就 已经 发 现 的 ：二 是 历 时 长 ，一 般 需 要 十 到 二 十 年 的 时 间 。 随着 人 类 基 因组 计 划 的完 成 和 蛋 白组 学 研 究 的开 展 ， 发 现 的 新 基 因 和 新 蛋 白 越 来 越 多 ， 人 们 从 中 看 到
克 隆 抗 体 在 疾 病 治 疗 方 面 的作 用 越 来 越 受到 人 们 的重 视 。 目前 美
国Ｆ ＤＡ 已 批 准 了 ３ 种 抗 体 治 疗 药 ２ 物 及 ７ 抗 体 融 合 蛋 白药 物 ， 其 中 种 鼠 单 抗 ３ ，嵌 合 抗 体 ６ ，人 源 化 抗 体 １ 种 ， 人 抗 体 种 种 ３ ９ ， 抗 体 融 合 蛋 白７ ， 有 １ 个 用 于 治 疗 肿 瘤 ， 另 外 种 种 ３
单 克 隆抗 体 药 物 引 导 了生 物 技 术 的 第 二 次 革 新 浪
了希 望 ，但 是 如 何 尽 快从 众 多 的 基 因 中挑 选 出可 用 来
中 国 医药 技术 经 济 与 管理 Ｉ２ １ ． ０２４
４ １
国
研 发 新 药 的 基 因 ， 如 何 选 择 最 佳 的 技 术 方 法 来 挑 选 这 些 基 因 ，如 何 在 基 因和 蛋 白功 能 尚 未 充 分 了解 之前 开 发 药 物 ，如 何 建 立 抗 体 药 物 靶 标 筛 选 和 抗 体 药物 筛 选 技 术 ， 降 低 研 发 成 本 和 风 险 ， 这 些 都 是 生 物 医 药 产 业 所 面 临 的 重 大挑 战 。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
抗体药研发流程
抗体药研发流程抗体药研发流程抗体药是一种新型的生物制剂，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等领域。
抗体药的研发流程相对于传统的化学药物研发流程更为复杂，需要经过多个环节的筛选和验证，下面将详细介绍抗体药研发的流程。
1. 靶点筛选抗体药的研发首先需要确定一个合适的靶点，靶点是指疾病发生的关键分子或细胞，是抗体药发挥作用的目标。
靶点的筛选需要考虑多个因素，如靶点的生物学功能、临床意义、可靶向性等。
一般情况下，靶点的筛选需要通过生物信息学、基因组学、蛋白质组学等技术手段进行。
2. 抗体筛选抗体筛选是抗体药研发的核心环节，也是最为复杂的环节。
抗体筛选需要通过多种技术手段，如酶联免疫吸附实验（ELISA）、细胞表面抗原检测、流式细胞术等，对大量的抗体进行筛选和鉴定。
在抗体筛选的过程中，需要考虑抗体的亲和力、特异性、稳定性等多个因素。
3. 抗体表征抗体表征是对抗体药的质量进行评估的过程，包括抗体的结构、亲和力、特异性、稳定性等多个方面。
抗体表征需要通过多种技术手段进行，如质谱分析、核磁共振、表面等离子共振等。
4. 功能验证抗体药的功能验证是对抗体药的生物学活性进行评估的过程，包括抗体的细胞毒性、免疫调节作用、抗炎作用等多个方面。
功能验证需要通过体外和体内实验进行，以评估抗体药的生物学活性和安全性。
5. 动物实验动物实验是对抗体药的药效学和安全性进行评估的过程，包括药代动力学、药效学、毒性学等多个方面。
动物实验需要进行多个剂量的给药实验，以评估抗体药的药效和安全性。
6. 临床试验临床试验是对抗体药的临床疗效和安全性进行评估的过程，包括临床前试验、临床一期、临床二期、临床三期等多个阶段。
临床试验需要进行多个剂量的给药实验，以评估抗体药的疗效和安全性。
7. 上市审批上市审批是对抗体药进行审批的过程，需要提交多个文件和报告，如药物注册申请、药物临床试验报告、药物质量控制报告等。
上市审批需要通过多个环节的审批，如药品注册、药品审批、药品监管等。
单克隆抗体的临床应用
单克隆抗体的临床应用随着生物技术的迅猛发展，单克隆抗体（Monoclonal Antibodies, mAb）作为一种重要的药物类别，已经在临床领域展现出了巨大潜力。
单克隆抗体通过特异性地结合到靶标分子上，可以识别和抑制疾病相关的分子，并发挥治疗作用。
本文将讨论单克隆抗体的原理、制备方法以及其在临床应用中的重要性。
一、单克隆抗体的原理单克隆抗体是由相同免疫球蛋白结构的同一种细胞克隆分泌的抗体所组成。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性和单一的抗原结合位点。
这使得单克隆抗体在临床应用中更为理想，特别是在诊断和治疗方面。
单克隆抗体的制备方法包括小鼠杂交瘤技术和基因工程技术。
小鼠杂交瘤技术是最早用于单克隆抗体制备的方法之一，其基本原理是将抗原与小鼠免疫后，脾细胞中的B细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0或NSO细胞）融合，形成杂交瘤细胞（hybridoma）。
随后，通过限制稀释法或ELISA等筛选方法，筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
尽管这种方法相对成熟，但存在一定的局限性，例如不适用于高度保守的抗原、与人类非常相似的抗原等情况。
基因工程技术则是一种更加先进且灵活的制备单克隆抗体的方法。
通过将人源或人-小鼠杂交的抗原受体基因导入到免疫缺陷小鼠的胚胎中，培育出能够产生人性化或全人源的抗体的小鼠。
然后，从这些小鼠中获得B细胞，利用单细胞PCR或限制酶切法获取到单克隆抗体的基因。
接着，将这些基因导入到真核表达系统（如CHO细胞）中，使其表达并生成单克隆抗体。
基因工程技术的优势在于可以避免小鼠免疫时产生的抗体与人体抗体产生的免疫反应，并且可以人为地修改抗体的特性，提高其稳定性、亲和力等。
二、单克隆抗体在临床应用中的重要性1. 诊断应用单克隆抗体在诊断领域有着广泛的应用。
例如，通过与荧光染料或放射性同位素标记的单克隆抗体结合，可以制成高度敏感的免疫组化试剂盒，用于肿瘤组织的检测和鉴定。
此外，在流式细胞术中，单克隆抗体与细胞表面的特定抗原结合，可以快速识别和分离不同类型的细胞。
单克隆抗体药物的工艺流程
单克隆抗体药物的工艺流程单克隆抗体是一种可以针对特定目标进行精确识别和结合的抗体分子。
其药物的生产工艺流程，主要包括以下几个步骤：目标选择、免疫原制备、免疫动物免疫、脾细胞融合、杂交瘤筛选、培养与扩增、纯化和质量控制。
首先是目标选择阶段。
药物研发的第一步是确定需要针对的目标抗原。
这个目标可以是各种病原体、肿瘤细胞表面的标志物或其他疾病相关的分子。
根据目标的特点和需要，选择适合的抗原供应商或制备抗原。
接下来是免疫原制备阶段。
根据目标的特点，选择适当的方法制备免疫原。
对于蛋白目标，可以选择原生蛋白的制备或者通过重组DNA技术表达蛋白。
对于不易制备的小分子目标，可以选择合成类似物或使用偶联剂将其与蛋白载体结合。
然后进行免疫动物免疫阶段。
将免疫原注射到动物体内，引发免疫反应以产生抗体。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子等。
在选择动物时，需要考虑动物模型的相似性以及抗体的产量和质量等因素。
脾细胞融合是下一个关键步骤。
在免疫反应完成后，从免疫动物中采集脾脏，获得抗体产生的B细胞。
然后与肿瘤细胞进行融合，产生杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有合成抗体的能力，并能不受限制地生长和扩增。
接着是杂交瘤筛选阶段。
将杂交瘤细胞分装到微孔板或培养瓶中，每个孔内只有一个杂交瘤细胞。
之后进行筛选，通过ELISA等方法，对细胞培养液中的抗体进行检测，筛选出具有特异性和高亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞。
杂交瘤筛选之后是培养与扩增阶段。
将筛选出的单个杂交瘤细胞进行培养和扩增，使其维持稳定的生长状态。
为了获得高产量和高质量的单克隆抗体，需要对培养条件进行优化，包括培养基配方、培养温度、CO2浓度和培养时间等。
然后是纯化阶段。
通过离心、过滤等方法，将细胞产生的抗体分离和纯化。
这个步骤还需要一系列的亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等纯化工艺步骤，以获得高纯度的抗体。
最后是质量控制阶段。
对纯化后的抗体进行质量控制，包括亲和度、结构完整性、生物活性等方面的检测。
单抗药物开发流程
单抗药物开发流程
一、前期研究阶段
1.确定疾病靶点
（1）研究疾病发病机制
（2）确认治疗靶点
2.筛选单抗候选物
（1）建立单抗文库
（2）进行体外筛选实验
二、前期开发阶段
1.克隆单抗基因
（1）提取mRNA
（2）克隆单抗基因序列
2.表达和纯化
（1）转染表达细胞
（2）纯化单抗蛋白
三、体外实验阶段
1.细胞实验
（1）体外细胞抗体结合实验
（2）功能性细胞实验2.生物活性评价
（1）抗体中和实验（2）细胞凋亡实验
四、动物实验阶段
1.动物毒性试验
（1）急性毒性试验（2）亚慢性毒性试验2.药效学评价
（1）动物模型建立（2）药效学实验设计
五、临床前开发阶段
1.毒性研究
（1）完善毒性试验数据（2）制定安全方案
2.临床试验策略
（1）制定临床试验计划（2）提交临床试验申请六、临床阶段
1.临床试验阶段
（1）临床试验招募
（2）进行临床试验
2.新药申报
（1）收集临床试验数据
（2）提交新药申报资料
七、审批上市阶段
1.新药审批
（1）监管部门审批
（2）药品注册
2.上市销售
（1）生产批准
（2）发布上市通知
以上是单抗药物开发流程的详细。
科普单克隆抗体药物研发进展
科普单克隆抗体药物研发进展自从1986年第一个鼠源性单抗药物问世，经过30多年的快速发展，单抗药物目前已经成为全球生物制药增长最快的细分领域，诞生了数个年销售额超过50亿美元的“超级重磅药物”。
截至2021年6月，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准104个抗体药物，涵盖肿瘤、自身免疫性疾病、心血管和神经性疾病、抗感染、罕见病等治疗领域。
根据国家药品监督管理局网站数据统计，我国共批准42个进口抗体药物。
近年来，我国的抗体药物产业也有了迅速的发展，目前已有31个国产抗体药物获批上市，其中有21个为2018年之后获批。
通过查阅文献和相关数据库，本文将对经典的单克隆抗体药物、抗体偶联药物和双特异性抗体的研究进行汇总、梳理，为行业提供参考。
1 经典的单克隆抗体药物（1）抗肿瘤抗体药物抗体药物目前已成为肿瘤治疗最有效的手段之一。
据Pharmaprojects数据库统计，目前临床研究和已上市的抗体中近50%用于肿瘤治疗。
上市抗肿瘤抗体药物涉及20多个靶点，针对热门靶点如PD-1/PD-L1、HER2等抗体药物占据了绝大部分的市场份额；其他靶点主要有造血分化抗原CD3、CD19等，生长因子及受体VEGF/VEGFR等，细胞间质及外基质抗原αVβ3等，实体瘤糖蛋白CEA等，糖脂类GAN-GD2等。
近年来，针对新的肿瘤靶点也在不断探索，其中Claudin18.2是在癌细胞中广泛表达的一种高度选择性的分子，是一种广受关注的理想靶点。
（2）免疫检查点类抗体药物肿瘤免疫靶向治疗作为一种新型的治疗手段，改变了晚期恶性肿瘤的临床治疗方式，也极大地扭转了依赖放疗、化疗和手术等癌症治疗手段的现状。
其中PD-1/PD-L1和CTLA-4是当前研究最为广泛的抑制性免疫检查点，目前获批上市的CTLA-4抗体只有伊匹木单抗，用于治疗黑色素瘤。
截至2021年8月，我国已批准上市10种PD-1/PD-L1抗体药物，包括4种进口药物和6种国产药物，适应症包括黑色素瘤、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤等。
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Herceptin (control) log(agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters) Best-fit values Bottom Top LogEC50 0.6537 31.88 -2.545
50 40 30 20 10 0 -10 10 -4 10 -2 10 0 10 2
4℃孵育 过夜
封闭
孵育一 抗
孵育二 抗
显色及 终止
• 间接法ELISA建立流程
优化案例
使用标准品建立实验时，假设二抗工作浓度已经确定，不同抗原浓度与一抗浓 度正交实验
前 沿 进 展
Keytruda——FDA批准的第一个程序性死亡受体-1（PD-1)单抗 MSD旗下明星药物，旨在 利用人体自身的免疫系统
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
V E G F ,n g /m l
VEGF
Best-fit values Bottom Top LogEC50 HillSlope EC50,ng/ml Span
117.7 526.2 0.6934 1.875 4.936 408.6
Bottom Top LogEC50 HillSlope EC50,ng/ml Span
Neutralizing Anti-drug antibody, NAb
评估ADA是否 会影响药效 cell-based non-cell-based
包被抗 原
• 优化包被液种类 • 优化抗原浓度
• N.A. • 优化封闭液种类及浓度 • 优化一抗梯度稀释的跨度、倍数 • 优化孵育时间、温度 • 优化二抗工作浓度 • 优化孵育时间、温度 • 加TMB后避光孵育显色，10-30 min后适 时终止
单克隆抗体药物的临床前研发
大分子药物——生物制药
始于1982年用重组DNA技术进行生物合成的人胰岛素(rHI)
举例
激素 (胰岛素，胰高血糖素，生长激素) 造血生长因子(Erythropoietin, colony stimulating factors) 干扰素 (Interferons-α, -β, -γ) 白介素 (Interleukin-2) 疫苗 (Hepatitis B surface antigen) 肿瘤坏死因子 治疗用酶 单克隆抗体
抵御癌症
热门靶点：免疫检查点 （Immune Checkpoint）如 PD-1、PD-L1、CTLA-4、
Tim3、LAG-3、VISTA等
谢谢！
THANKS FOR ATTENTION.
2015-11-18
经典靶点
单克隆抗体的制备
抗体的人源化
嵌合抗体：应用DNA 重组技 术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗 体基因的恒定区重组, 再将重组后的 基因导入骨髓瘤细胞中表达 CDR 移植抗体（改型抗体）：进 一步用人的编码构架区( FR) 替代鼠FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即除了3 个CDR 是鼠源的外, 其余全部是人源结 构 完全人源化抗体：1、噬菌体抗体 库技术；2、转基因小鼠技术
100
R itu x a n m e d ia te d C D C o n D a u d i
120
80 70 60 50 40 30 20 10 0
% T a rg e t C e ll L y s is
% T a rg e t C e ll L y s is
90
100 80 60 40 20 0 10 -2 0
A v a s tin
100
600
% c e ll p ro life ra tio n ra te
####
500 400 300 200
% c e ll v ia b ility
80 60 40 20 0
100 0 10
-2
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-4Leabharlann 10-310
-2
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-1
10
0
10
1
c o n c . ,μ g / m l
单 抗 药 物 作 用 机 理
靶点 CD20 Her2
表达细胞 Daudi,raji,RPMI-8226
抗体药 利妥昔单抗 （Rituximab）
商品名
厂家
罗氏 美罗华 （Rituxan）
MDA-MB-231,MCF-7,SK-OV-3 曲妥珠单抗 罗氏 赫赛汀 （Trasduzumab） （Herceptin）
Avastin 25.7 101.1 -1.386 -1.8 0.04107 75.4
Pharmacokinetics, PK
主要评估血清中药物水平， 不被肾脏清除，半衰期长； 单抗的主要代谢结果是降 解为肽段和氨基酸，无需 进行生物转化研究 评估免疫原性， 是否产生ADA
药动评价
Anti-drug antibodies, ADA
cell proliferation and antibody neutralization
药 效 筛 选
V E G F In d u c e d H U V E C P r o life r a tio n
120
H U V E C n e u tr a liz a tio n a s s a y
EGFR
TNFα VEGF
A431,A549
CHO-DG44-tnfα HUVEC
西妥昔单抗 （Cetuximab）
爱必妥 （Erbitux）
默克－雪 兰诺
雅培 阿达木单抗 修美乐 （Adalimumab） （Humira） 罗氏 贝伐珠单抗 阿瓦斯汀 （Bevacizumab） （Avastin）
HillSlope
EC50,μg/ml
1.118
0.002854
Ab Concentration, [g/ml]
CDC--CTG
# # # m e d ia te d C D C L y s is o n U 9 3 7
药 效 筛 选
_ N H S C o n c . o p tim iz a tio n
-1
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0
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1
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2
μ g /m l
%
%
0
0
2
NHS Conc.
1
5
%
Rituxan log(agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters) Best-fit values Bottom 6.625 Top 100.1 LogEC50 -0.5091 HillSlope 3.069 EC50, μg/ml 0.3096
来源于细菌、酵母、 昆虫、植物和哺乳动 物细胞等各种表达体 系
背景知识
临床试验
药动评价
药效筛选 单克隆抗体的制备 靶点的发现与选择
研发流程
靶点的发现和选择
集中在细胞死亡通路、血管生成、细胞周期调控信号转导等方面 例如： CD20 :表达于B细胞和成熟B细胞，调节B细胞增殖、分化；在 95%以上的B细胞性淋巴瘤中表达 抗CD20单抗可用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤 单抗药物工作机理： 抗体依赖性细胞介导的毒作用( antibody dependent cellmediated cytotoxicity, ADCC) 补体依赖性细胞毒作用( complement dependent cytotoxicity, CDC) 中和细胞因子
by抗体生产部门
功能鉴定： ADCC, CDC, 中和细胞因子
by药效部门
药效筛选
ADCC—LDH release
药 效 筛 选
ADCC Assay on SK-BR-3 Cells with NK92-CD16A
70 60
Herceptin(control) ####
% Target Cell Lysis