植物酯酶提取工艺
酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷农药残留
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江苏农 业科 学 ２ ０ ０ ６年第 ５期
在 １ ｉ 则基 本达 到稳 定 （ ９ 。 因此 ， 定 最 ０ｒｎ后 ａ 图 ） 确
出限为 ０ １ ｇｍ 。样品提取过程 中， ．３ ／ ｌ 分别采用加 入 １％的甲醇 、 ０ 乙醇和丙酮溶液 ， 结果显示（ １ ） 图 １ 有机溶剂 的加入 可有效提高农药 的提取效率 ， ３种 有机溶剂差异不是很 明显 ， 乙醇的提取液的 回收 但 率要略高于其他 ２ 种溶剂 ， 因此 ， 提取液确定为含有 １％乙醇的０ １ ｏ Ｌｐ ０ ． ｍ ｌ Ｈ值 ６５的磷酸缓冲液。 ／ ．
中植物酯酶活性 ， 优化 了植物酯酶提取条件 。同时系统地研究 了酶促反应条件 ， 建立 了酶抑制法快 速检测蔬菜 中 有机磷农 药残 留的方法 研究结果表 明， 以绿豆中提取的粗酶酶活最高 ， 提取条件 为 ： ０ １ｍ ｌＬｐ 以 ． ｏ Ｈ值 ６ ２的 ／ ． 磷酸缓冲液为提取剂 ， 按固液 比 １： （ Ｖ） 料 ， ４ ５ ｗ／ 加 在 Ｏ℃搅 拌 ２ ｉ， 滤。最佳 酶促 反应条 件为 ： ０ｒ ｎ 过 ａ 反应 体系 ０ １ｍ ＬＬｐ ． ０／ Ｈ值 ６０磷 酸缓 冲液 、 ． 反应时 间 １ ｉ、 ５ｒｎ 反应温度 ４ 显色时 间 １ ｉ、 ａ ０ｃ Ｃ、 ０ｒ ｎ 测定波长 ５０ｎ ａ ２ ｍ处吸收峰 值； 样品提取用 含 １ ％乙醇的 ０ １ｍ ｌＬｐ ０ ． ｏ Ｈ值 ６ ４的磷酸缓 冲液 超声 波振荡 １ ｉ； ／ ． ０ｒ ｎ 方法 的 回收率 为 ８ ． ％ ａ ６７
端 。近几年发展起来的酶抑制法具有 方法 简单 、 快 速、 适合现场检测和粗筛等优点 ， 但现行国标中采用 的乙酰胆碱酯酶价格较高。有报道采用植物酯酶替 代 乙酰胆碱酯酶 ， 由于植物酯酶酶源不同 ， 但 不同植 物对有机磷农药的敏感性 差异较大 ， 以筛选活性 所 高、 敏感性好 、 高效价廉的植物酯酶 ， 优化检测条件 ，
植物组织中脂肪的检测方法
植物组织中脂肪的检测方法
植物组织中脂肪含量的检测是研究植物营养和生理过程的重要手段之一。
准确测定植物组织中脂肪的含量可以帮助我们了解植物的能量储存和代谢过程。
以下是一些常用的植物组织中脂肪的检测方法：
1. 溶剂提取法：这是一种常见的脂肪提取方法，利用有机溶剂（如正己烷、乙醚等）将脂肪从植物组织中提取出来。
首先，将植物组织样品切碎并加入溶剂中，然后反复摇晃或搅拌，使脂肪溶解在溶剂中。
最后，通过离心将溶剂中的脂肪分离出来并干燥，得到脂肪含量的测定结果。
2. 比色法：这是一种常用的脂肪含量测定方法，可以利用底物在酶的作用下产生的色素与脂肪的含量成正比，实现对脂肪的定量测定。
常见的比色法包括乙酰丙酸酯酶法、甘油酸酯酶法等。
3. 气相色谱法：这是一种高效、准确的脂肪分析方法，常用于分析复杂的脂肪组分。
通过将植物组织样品中的脂肪转化为甲酯化脂肪酸，再通过气相色谱仪分析样品中各脂肪酸的含量和种类。
4. 超声波法：超声波法可以快速有效地破碎植物细胞膜，释放其中的脂肪。
该方法可以在不需要显微操作的条件下，提取植物组织中的脂肪，并利用其他方法进行后续的脂肪含量测定。
总结起来，植物组织中脂肪的检测方法主要包括溶剂提取法、比色法、气相色谱法和超声波法。
选择适合自己研究目的和样品特性的方法，能够准确测定植物组织中脂肪的含量，为进一步研究提供重要的数据基础。
常用酶制剂的生产方法
常用酶制剂的生产方法引言：酶是生物体内一类高效催化剂，具有高效催化、高度特异性和温和条件下反应等特点。
其广泛应用于医药、食品工业、环境保护等领域。
本文将讨论常用酶制剂的生产方法。
一、酶的筛选酶的筛选是酶制剂生产过程中的关键步骤。
常用的筛选方法包括传统筛选、分子筛选和基因工程筛选。
1.传统筛选：传统筛选基于酶催化反应产物的定量或定性分析。
通过观察反应产物的形成情况，筛选出具有高催化活性的酶。
传统筛选方法常用于挑选一些常见酶制剂，如蛋白酶、淀粉酶等。
2.分子筛选：分子筛选基于酶底物和产物的结合力。
通过制备一系列结构类似的化合物，分析它们与酶的结合力，从中选择出对目标底物具有高结合力的分子。
分子筛选常用于筛选特定底物的酶制剂，如酯酶、脱氢酶等。
3.基因工程筛选：基因工程筛选基于对酶基因进行改造，通过体外酶活性的分析来筛选出符合要求的酶制剂。
常见的基因工程筛选方法包括突变筛选、重组融合和高通量筛选。
二、酶的提取和纯化酶的提取和纯化是酶制剂生产的重要步骤，常用的方法包括固液分离、沉淀、超滤等。
1.固液分离：固液分离是将酶从固态生物质或液态培养基中分离出来的过程。
常见的固液分离方法包括离心、过滤和压滤等。
该方法适用于酶制剂生产中的初步提取。
2.沉淀：通过添加盐类或有机溶剂，使酶沉淀成块，然后通过离心或过滤将其分离出来。
此方法可用于酶的粗提和初步分离。
3.超滤：超滤是一种利用超过膜孔大小的压力将溶液中的大分子物质与溶剂分离的方法。
通过选择合适的膜孔大小，可将酶和低分子物质分离开来，达到酶的纯化目的。
三、酶的固定化酶的固定化是将酶以固定形式嵌入在载体上，提高其稳定性和循环使用性能。
常用的固定化方法包括吸附、交联和包埋等。
1.吸附：酶通过静电作用、吸附剂（如硅胶、活性炭等）的架桥作用，被吸附在载体表面。
吸附方法简单易行，适用于大分子酶制剂。
2.交联：酶通过与载体交联剂的共价结合，被固定在载体上。
交联固定化技术可以提高酶制剂的稳定性和催化效率。
复合磷酸酯酶两种提取工艺的比较
押权优先效力 的体现 。但抵押权人欲实现其抵 押权的优 先效力必须 满足两个 条件 ： 一是抵 押 权 有效成 立 ，若 为无 效之 抵押权 ，则 不得 实 行 ；二是债权 已届清偿期而未受清偿 ，即抵 押 权优 先效力 的实行不仅以债权的有效存 在为前 提 ，并且须有债务人给付迟延之事实方可。所 谓 给付迟延是指债务 已届履行期而 未为给付 。 倘 债权尚未届清偿期 ，则不得实行抵 押权的优 先效力 。即便 已届清偿期 ，而债务人如期清偿 者 ，则抵押权归 于消灭 ，故无实行抵押权优 先 效 力的可能 。因此 ，行使抵押权优先效力以给 付 迟 延 为必 要 条 件 。 ３ ． ２抵押权优先效力的实行方法 根据 《 担保 法》 第 ５ ３条第 １款之 规定 ， 债务履行期届满 ，抵押权人未受清偿 的 ，可 以 于抵 押人协议 以抵押物折价。抵押权人欲以抵 押 物折价 ，必须依据 其与抵押人之 间的协议 。 所谓 以抵押物折价 ，是指 以抵押权人所应受清 偿 的债权额作为价款之一部或全部，以取得抵 押物的所有权 。这是抵押权优先效力得 以实现
的。
２４损 害赔 偿金 。 它是 有代 替 给付 的性 ． 质 ，如果不包括在抵押权优先效力范 围内，实 难保护债权人 的利益。与违约金一样 ，损 害赔 偿金在办理抵押登记时无须登记 ，当然属 于抵 押权优先效力范围 。 ２５实现抵押权 的费用 。抵 押权人因为行 ． 使抵押权而 支出的费用 ，应 当由债务 人负担 ， 并受抵押担保的保障。实行 抵押权 的费用 ，包 括拍卖、变 价抵押物所必须支出的费用 ，即申 请费用，拍卖费用等。抵押权人若依照诉讼程 序请求法 院拍卖或变价抵押物的 ，法 院因强制 执行 而支 出的全部费用 ，应当由抵押物优先受 偿 ；抵押权人 以诉讼外的方法变价抵押物而支 出的费用 ，因为直接产生于抵押权 的行使 ，应 当由抵押物 的变价款优先受偿。因此 ，实 现抵 押权 的费用也应当在抵押 权优先效力范 围。 ２ 保 法》 在 规定 了以上 五种 抵押担 ． ６ 保的范 围外 ，另据意思 自治的原则 ，允许 当事 人在合 同中经合意所约定 的抵押物 应担保 的范 围 ，如债权人为实现其债 权而委托代理人 的代 理费用、公证费用等。 ３抵押权优先效力的实现 ３１ ．抵押权优先效力的实行条件 当债务履 行期届满 而抵押 权人未 受清偿 时 ，抵押权人可就抵押物优先受偿 ，这就是抵
脂肪酶的提取与分离纯化
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3.2.1 ATPS系统的选择
连接带长度的影响 ：
研究了不同的连接带长度在体积比维持在1左右时PEG/NA2HPO4系统的影响 。表3A代表在各自系统不同连接带长度下的脂肪酶分配情况。在MTCC5695脂 肪酶最大脂肪酶回收率为85.95％的情况下，高纯化因子为4.51，比活力为 4024.56U / mg，TLL为41.24％。超过41.24％，MTCC5695的脂肪酶产量下 降，从85.95％降至57.43％。 在任何一种情况下，分离更倾向于底相。 随着两 相成分组分的浓度增加，两相的自由体积减小。
金属离子
组特异 性试剂
修饰剂 温度
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3.1 MTCC5695脂肪酶活力的影响因素
PH
MTCC5695脂肪酶显示在pH值10.8的最佳活性表明它是碱性的。
PH值在7.0-12.0之间时酶呈现了稳定性。在强酸性环境下，活动完全丧失
了活性，pH值为6.0时，酶活性很弱。
温度
MTCC5695脂肪酶活性的最佳温度是40度。脂肪酶在30-70摄氏
最适宜的系统是磷酸氢二钠系统，其中恢复率为61.87%的脂肪酶具有特 异性活性417.43U/mg和净化因子2.62。对细胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和小 麦面粉的植物酯酶被ATPS提取和纯化效果不错，净化因子(PF)为18.46倍，产 量为83.16%。
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3.2.1 ATPS系统的选择
相形成高聚物的影响
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3.2.2 双水相萃取技术的分离与超滤
底相的超滤作用下使得磷酸钠与MTCC5695脂肪酶分 离，从而将纯化因子从4.12提高到5.99，酶的回收率为 82.09%。纯度的增加可以归因于通过膜和磷酸钠进行的 污染物蛋白的渗透。超滤装置的使用促进了MTCC5695脂 肪酶的分离;这反过来又增加了浓度，而纯度却未受影响。 先前的研究报告说，膜处理(超滤)与ATPE的整合不仅促进 了相形成成分与产品的分离，而且也增加了蛋白的纯度。
酶的生产方法.ppt
（五）生产种子的制备
生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用 于发酵罐接种的大量菌体。
1、种子制备工艺过程
养
接种至发酵罐
（1 ）菌种活化
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接 种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以 恢复细胞的生命活动能力。
为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段 控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度 范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。
（3）温度的控制方法
一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有 足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。
4、酵母
啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。
假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢 酶等。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶 α-淀粉酶
产酶微生物
枯草芽胞杆菌 地衣芽胞杆菌
米曲霉
用途
淀粉液化，织物退浆，消化 助剂，加酶洗涤剂
米曲霉，黑曲霉， 制造葡萄糖，发酵、酿酒等
葡萄糖淀粉酶
此外石油产品中12碳—16碳的碳氢化合物已成功用作微生 物培养基的碳源。
注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的 碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。
2、氮源：提供氮元素。
来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的 副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；
②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、 NH4NO3 、NaNO3和（NH4）3PO4等。
玉米粉 8%
豆饼粉 4%
磷酸氢二钠 0.8%
硫酸铵
0.4%
氯化钙
0.2%
氯化铵
酯酶同工酶电泳技术
酯酶同工酶电泳酯酶是催化酯类化合物水解的酶系，目前已发现的酯酶至少有20种。
植物酯酶同工酶的分离技术多采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，主要操作步骤介绍如下。
一、试剂按表1配制贮液和工作溶液---表1 贮液和工作溶液配制用量注：贮液放在冰箱中一般可保存1～2月，3号贮液只能保存1周。
Acr=丙烯酰胺，Bis=甲叉双丙烯酰胺，TEMED=四甲基乙二胺，Tris=三羟甲基氨基乙烷。
二、制胶1、由于电泳槽的构造因厂家不同而有所差异，可按电泳槽所附说明书组装好胶板。
2、按上表配制好分离胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间，至板顶3cm即可；然后沿着玻璃板壁缓慢加入3～5mm蒸馏水层。
刚加水时看出有界面，后逐渐消失；等到再看到界面时表明凝胶已经聚合（一般约30分钟）；再静置30分钟使聚合完全。
3、用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液。
按上表配制好浓缩胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间以冲洗分离胶的顶部。
迅速吸出，立即灌注浓缩胶，当灌至凹型玻璃口3mm处停灌，立即插入样品梳，使凝胶液面高出玻璃1～2mm。
然后在距日光灯管10cm处照射进行光聚合。
当看到浓缩胶显乳白色（一般6～7分钟），表明聚合开始。
继续半小时，使聚合完全。
三、电泳1、样品提取取烟苗0.2克，加0.5毫升提取缓冲液（含0.075M Tris-HCl，pH7.5，0.01M KCl，0.01M MgCl，0.001EDTA，5%蔗糖，0.1%巯基乙醇，5%PVP-2聚乙烯基吡咯烷酮），冰块上研磨成匀浆，低温下12000rpm离心15分钟，取上清液置于冰箱中备用。
提取缓冲液种类较多，这里介绍的提取缓冲液本实验室曾采用过，可据需要参看其他提取方法。
2、点样拔出样品梳，吸取样品槽中的水分。
用微量移液器加入适量样品液（一般50微升左右）。
用移液器缓慢加入电极缓冲液，以覆盖样品。
三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇
三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究1蛋白酶是一类具有水解蛋白质能力的酶，广泛存在于细胞中并参与多种生物学过程。
在生物制药等领域，蛋白酶的纯化、性质及应用研究具有重要的现实意义。
本文将重点介绍来自植物、细菌和真菌三种不同来源的蛋白酶在纯化、性质和应用方面的研究进展。
一、植物蛋白酶的纯化、性质和应用植物蛋白酶主要存在于种子、果实、根茎等植物组织中，其中的大多数是半胱氨酸蛋白酶。
植物蛋白酶的纯化主要采用柱层析法和电泳法等技术。
研究表明，植物蛋白酶的氨基酸序列存在着相似性和区别性，其中一些同源物可以分为家族或亚家族。
此外，植物蛋白酶的活性受到温度、pH值和抑制剂等因素的调节。
植物蛋白酶在食品加工和医药制品等方面可发挥重要作用。
例如，灵芝多肽可以被植物蛋白酶水解成具有生物活性的多肽物质，这对于灵芝多肽的生产具有重要意义。
另外，复合酶制剂SiOpro可以通过作用于面团中的酯酶、氧化酶和蛋白酶等多种酶的协同作用，达到改善松软度、延长保质期等目的。
二、细菌蛋白酶的纯化、性质和应用细菌蛋白酶主要可分为内质网蛋白酶和外源性蛋白酶两种。
前者在细胞内、后者在菌体周围均有分布。
细菌蛋白酶的纯化常常采用柱层析技术和亲和层析技术等，具有高效、快速、经济等优势。
细菌蛋白酶在医药、食品及皮革制品等方面应用广泛。
例如，基于外源性蛋白酶的制剂Accutase是用于脱离培养细胞的酶，具有无细胞毒性、操作简单等特点；生产蛋白药物方面，葡萄球菌的外源性蛋白酶已被用于制备重组蛋白；在食品加工过程中，外源性蛋白酶可以提高油脂的提取效率和品质。
三、真菌蛋白酶的纯化、性质和应用真菌蛋白酶可分为胶原酶和无胶原酶两大类。
前者主要用于胶原的加工，后者则广泛应用于食品加工、纸张制品、色谱等领域。
真菌蛋白酶的纯化方法有很多种，包括柱层析、电泳、反向相色谱法等。
真菌蛋白酶在pH值、温度、金属离子和阻碍剂等条件下均表现出不同的活性和特异性。
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植物酯酶提取工艺：
（1）酶活测定条件的优化，如pH值，时间，底物浓度，显色剂用量及浓度等。
（2）植物酯酶或胆碱酯酶的溶剂提取条件的确定如：溶液的种类、固液比、温度、时间等。
（3）纯化条件如超滤、凝胶、离子交换等条件的确定。
（4）经纯化后的纯酶的酶学性质如：热稳定性、pH稳定性、金属对酶活性的影响。
1、标准曲线的绘制
称取0.0036gα-萘酚（分子量：144.17），溶解于无水乙醇中，定容至100mL，得0.25mmol/L溶液。
分别移取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mLα-萘酚溶液，用磷酸缓冲液稀释至10mL。
在各比色管中分别加入0.5mL0.08%固兰B盐3.6%SDS显色剂，置于30℃恒温水浴5min后做光谱扫描，并在最高吸收峰测吸光度。
用测得的结果做标准曲线。
1）PH的影响
磷酸缓冲液：6、6.5、7、7.5、8
比较：以缓冲液为空白作基线，固兰B盐+缓冲液扫描，求出A0，比较大小。
不同PH条件下，各最大吸收波长偏移情况，及A值大小。
不同pH条件下，其标准曲线线性
2）固兰B盐的浓度影响
1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.08%、0.02%等，求出A0，以缓冲液为空白作基线
不同浓度下，做标准曲线
将固兰B盐放置，每天测A。
，估计能放置保存天数。
3）加入SDS浓度
0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、3.6空白，A0
取一中间浓度的扫描求最大吸收波长，及A
于冰箱及常温下放置，求A、A0
确定最佳浓度及固兰B盐能放置的时间。
取0.5mL稀释酶液，加入4.5mL缓冲液（可定容至5mL），加入0.5mLα-
乙酸萘酯溶液，30度，反应5min，缓冲液定容至10mL，加入0.5mL固兰B盐，置于30℃恒温水浴5min
1)乙酸萘酯乙醇溶液浓度影响
0.04、0.02、0.015、0.0005等测（萘酯+显色剂）A0，及A，最大吸收波长
2）加入乙酸萘酯溶液体积的影响
4）最后恒温水浴时间、温度的选择
5）初始缓冲液pH选择
6）酶液的稀释倍数
于固液比（1：7）水,于35度，150rpm ,振荡30min提取，4度，
1）固液比
2）温度选择
3）反应时间
4）提取液的种类（水、不同pH）5）转速。