无菌检查法

•
作：
红色塞子
滤膜
黄色塞子
夹子
取样针
采用封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45μm直径约为50mm 。根据供试品
及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
③实验操作：
• 操作时，首先点燃酒精灯，用75％乙醇棉球擦拭双手和供试品外壁及瓶塞。
5.实验结果判定
• 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。 否则，试验无效。 • 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无细菌生 长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显 浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非 能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试 品所含。当符合下列至少1个条件时方可判试验结 果无效： （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控 结果不符合无菌检查法的要求。 （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污 染的因素。
•
过滤器安装：在超净工作台内打开过滤器的包装，将滤筒分别放于引流盘 的插口上，将过滤器的导管安装在过滤泵泵头上。
红色胶塞
•
引流盘 预湿膜：将过滤器上的针插入到冲洗液中,倒转冲洗液瓶,打开过滤系统的电 源开关，确认滤筒的呼吸器畅通后启动蠕动泵。当每个滤筒中有大约80ml 液体时，把倒转的冲洗液瓶转正，再在呼吸器上套上红色胶塞，待滤筒中 液体大约剩下20ml时，停止蠕动泵。
供试品过滤
• 取样针自冲洗液瓶中拔出后插入供试品中，调节泵速为10，确认滤筒的呼吸 器上套有红色胶塞后启动蠕动泵，操作过程中取样针要始终置于液面以下， 避免吸入外部的空气，待供试品全部过滤后停止蠕动泵。将供试品平均过滤 至三个滤筒。
加入培养基
• 过滤完毕后（注意导管中残留的液体也要全部打尽），三个滤筒底部用黄色 的塞子塞住，并确认滤筒的呼吸器上没有红色胶套。用夹子在尽量靠近取样 针的分叉处夹住一根导管，将取样针插入装量硫乙醇酸盐流体培养基中，启 动蠕动泵，倒转培养基瓶，往两个滤筒中加入培养基，并及时用记号笔于滤 筒上标记培养基的名称。 夹子夹住 黄色胶塞
5.实验结果判定
（3）阴性对照有菌生长。 （4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌 试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 • 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品， 依法检查若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长， 判供试品不符合规定。
无菌检查法
2011.09.09
目录
1. 2. 3. 4. 5. 6. 无菌检查用培养基的配制 培养基的灵敏度检查 无菌检查操作 培养及观察 实验结果判定 结束语
1.无菌检查用培养基的配制
• 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定 的脱水培养基。 • 无菌检查用的培养基包括：硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁
培养基。
• 稀释剂包括：(1)0.1 ％蛋白胨水溶液，(2) pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲
液(3 ) 0.9 ％氯化钠溶液 （仅用于上述2 种溶液不适用时使用）。
• 配制后的培养基和稀释液应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 • 制备好的培养基应保存在2 一25 ℃ 避光的环境，若保存 于非密闭容器中，一般可在3 周内使用；若保存于密闭容 器中，一般可在1 年内使用。
硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml ，改良马丁培养基每管装且不少
于10ml 。培养基的用量和高度同方法验证试验。
3.无菌检查操作
薄膜过滤法
① 实验仪器：
3.无菌检查操作
②实验准备：
• 无菌检查室每次操作前应开启房间和超净工作台的紫外灯，运行30 分钟以上才可使用。实验结束后用消毒剂将超净工作台面和桌面擦 拭干净并且开启紫外灯运行30分钟以上。 消毒液：无菌试验前应准备好消毒液，常用的消毒液有0.1％ 新洁 尔灭溶液、75%乙醇、0.02%二氧化氯及0.05%碘伏溶液等。 需要灭菌的用品：无菌衣、裤等洗净晾干，放入包装袋中，然后灭菌。 所有灭菌物品采用验证合格的灭菌程序灭菌。 其它：操作室准备好75％乙醇棉、酒精灯、打火机、镊子和剪刀常用 工具、记号笔等。 无菌操作前培养基、冲洗液、过滤器、供试品等物品应先用消毒液擦 拭表面，然后放入传递窗，经紫外灯照射30分钟后传入无菌检查室。 操作人员先用肥皂清洗双手，进入缓冲间，换鞋，再以消毒液浸泡双 手，然后按相关规定穿戴无菌衣、口罩进入无菌检查室。
分叉处
• • 同法操作，放松夹住的导管，用夹子夹住另外两根导管，往滤筒中加入改良 马丁培养基。 最后，用夹子在距离滤筒呼吸器约10mm的地方分别夹住导管，再用灭菌剪 刀在距离夹子约40mm的前端剪断导管，最后把剪开的管口插入套桶的呼吸 器上。
3.无菌检查操作
• 水溶液供试品 取规定量，每支（瓶）供试品装量为5ml 及以下者，全
3.无菌检查操作
无菌检查分类：直接接种法和薄膜过滤法。
直接接种法：
• • 等量直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。 取规定量供试品，分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中 （2 种培养基的接种支数或瓶数之比为2:1 ) 。除另有规定外，每个容器中培 养基的用量应符合接种的供试品体积，不得大于培养基体积的10%，同时，
2.培养基的灵敏度检查
培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5 代（从 菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第O 代），试验用菌 种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株 的生物学特性． 培养基的灵敏度检查所用到的菌种：
• • • • • • 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉
菌液制备
1. 2. 3. 4. 5. 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营 养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上。 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃ 培 养18～24 小时。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养 基上，20～25 ℃ 培养24～48 小时。 上述培养物用0.9 ％氯化钠溶液制成每lml 含菌数小于100CFU （菌落形 成单位）的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，23～28 ℃ 培养5～ 7 天，加入3～5ml 无菌的含0.05 % (ml/ml）聚山梨酯80的0.9 ％氯化钠 溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内， 用无菌的含0.05 ％〔ml/ml）聚山梨酯80 的0.9 ％氯化钠溶液制成每lml 含孢子数小于10OCFU 的孢子悬液。 菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用，若保存于2～8 ℃ 可在24 小时 内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8 ℃ ，在验证过的贮存期内使用。
6.
灵敏度检查方法
• 取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基9 支，分别接 种小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌、生孢梭菌各2 支，另1 支不接种，作为空白对 照，置30～35 ℃ 培养3 天 • 取每管装量为9 而的改良马丁培养基5 支，分别接种小于 100CFU 的白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种，作 为空白对照，置20～25 ℃ 培养5 天。 • 逐日观察结果。结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌 的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规 定。
部转移至含适宜稀释液100ml 的无菌容器内，混匀，立即过滤；每支（瓶） 供试品装量为5ml 以上者直接过滤，或全部转移至含适量稀释液的无菌容 器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗 液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3 次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法 验证试验。
• 水溶性固体供试品 取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，
然后照水溶液供试品项下的方法操作。
• 装有药物的注射器供试品 取规定量，将注射器中的内容物（若需要
可吸人稀释液或标签所示的溶剂溶解）直接过滤，或混合至含适量稀释液的 无菌容器内，混匀，立即过滤，然后按水溶性供试品项下方法操作。
4.培养和观察
• 阳性对照：以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。取其中1份硫 乙醇酸盐流体培养基，加入小于100cfu金黄色葡萄球菌， 34±1℃培养48~72小时应生长良好。 • 阴性对照：用与供试品同量的0.1%蛋白胨水代替供试品，同法 操作，作为阴性对照。 • 另一份接种后的硫乙醇酸盐流体培养基置30 ～35 ℃ 培养14 天； 另一份接种后的改良马丁培养基置20 ～25 ℃ 培养14 天，培养 期间应逐日观察并记录是否有菌生长。 • 如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14 天后，不能从外观上判断有无细菌生长，可取该培养液转种至 同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基 上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基 及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取 培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌 种鉴定。