无菌检查法及其验证(精选)
无菌检查法方法验证(妥布霉素滴眼液)
妥布霉素滴眼液无菌检查法方法验证一、验证目的根据中国药典2010年版（二部）附录XI H 无菌检查法方法验证，对妥布霉素滴眼液无菌检查方法进行验证，确定在设定的条件下能满足该产品的无菌检查需求，保证检验结果的可靠性。
二、供试品妥布霉素滴眼液规格：0.4ml/支。
批号：三、培养基硫乙醇酸盐流体培养基批号：中国药品生物制品检定所改良马丁培养基批号：中国药品生物制品检定所营养肉汤培养基批号：中国药品生物制品检定所改良马丁琼脂培养基批号：中国药品生物制品检定所营养琼脂培养基批号：中国药品生物制品检定所玫瑰红钠琼脂培养基批号：中国药品生物制品检定所营养琼脂对照培养基批号：中国药品生物制品检定所玫瑰红钠琼脂对照培养基批号：中国药品生物制品检定所四、试剂：蛋白胨批号：氯化钠（AR）批号：磷酸二氢钾（AR）批号：磷酸氢二钠（AR）批号：聚山梨酯80 批号：五、仪器HTY-2000A型集菌仪，一次性使用全封闭集菌培养器型号KDGB330批号20100602 均由杭州泰林生物技术设备有限公司。
立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-50SII，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；霉菌培养箱：MJX-160B-Z型，上海博迅实业有限公司生化培养箱：MJX-160B-Z型，上海博迅实业有限公司电热恒温鼓风干燥箱：GZX-9076 MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂百级超净工作台：SW-CJ-1F，苏州佳宝净化工程设备有限公司六、冲洗液pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，自制，根据《中国药典》2010版二部附录XI H 稀释液，冲洗液配置方法：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微热溶解，滤清，分装，灭菌。
灭菌条件：121°C高压蒸汽灭菌20min。
七、缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液，自制，根据《中国药典》2010版二部附录XIH 稀释液，冲洗液配置方法：取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证1. 概述将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。
2. 验证前提条件供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。
种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。
照此原则,多规格制品按下表选择供试品进行验证。
3. 验证方法3.1菌液制备3.1.1细菌菌液制备程序①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。
用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。
②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜面上，于30~ 35°C培养18h~24h。
取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。
③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
无菌检验方法验证
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无菌检验阳性结果调查
实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的
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无菌检验阳性结果调查
若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染 原因和污染源 –人 – 物料 – 环境 – 设备 – 方法和工艺
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个，
如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
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验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3 次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品 已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种 的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓 慢或不生长，说明供试品仍有抑菌活性，应考虑进 一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性， 并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低 抑菌活性。
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
药典无菌检查方法验证及操作要点
2. 培养基
2.1 培养基的灭菌 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
2.2 培养基的保存 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的
环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三 周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内 使用。
•
2.3 培养温度 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养
。改良马丁培养基置23～28℃培养。 2.4 培养基的适用性检查
•
黑曲霉
改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养5～7天，
加入3～5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗
脱
吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌
棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌
试管内
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢
子数小于l00cfu的孢子悬液。 •
4.3 薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲
药典无菌检查方法验证 及操作要点
2020年4月29日星期三
1 前言 1.1 定义
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药
品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方
法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明
了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
•
1.2 实验环境条件要求
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的 局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净 室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方 法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔 离系统按相关的要求进行验证，其内部环 境的洁净度须符合无菌检查的要求。
3）枯草芽孢杆菌
(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63 501]
无菌检验技术—无菌检查方法验证
• 3.3无菌检查的范围 • 凡进入人体无菌部位(人体的血液循环பைடு நூலகம்统、肌肉、皮下组织)或接触创
伤、溃疡面等部位而发生作用的制品或要求无菌的材料、无菌器具均应 进行无菌检查。对于规定灭菌的药物，包括注射剂及用于体腔、严重烧 伤、溃疡及眼科用药等，必须严格无菌，即在规定检验量的供检品中不 得检出活微生物。
任务3 无菌检验方法验证 知识点3 无菌检查方法
• 3 无菌检查方法 • 3.1无菌检查法概念 • 无菌检查法是指检查《中国药典》要求应无菌的药品、医疗器具、原料、 辅料及其他要求无菌的品种是否染有活菌的一种方法（供试品符合无菌检查 法的规定，仅进表明了供试品在该检查条件下未发现被微生物污染）。 • 为了保证药品的卫生质量，保证药品在临床上的安全使用和保障人民的健 康，《中国药典》规定：注射用药、灭菌的外用制剂等均需做无菌检查。
• 的制剂。心脏瓣膜以及固定金属板和有机器材等。
• (3)冲洗剂，即用于冲洗开放性伤口或腔体的冲洗剂。
• (4)眼用制剂。
• (5)用于烧伤、创伤或溃疡的制剂。包括：用于烧伤或严重创伤的局部用 散剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂；用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂和喷 雾剂等。
• (6)用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂或洗耳剂。 • (7)用于手术或创伤的鼻用制剂。 • (8)用于止血并可被组织吸收的制剂。如明胶发泡剂、凝血酶等，用于止
• 3.2验证目的 • 确认所用的无菌检查方法适用于“所有无菌产品”的无菌检查。 • 确保检查结果的准确性、可靠性、准确性和重现性以及检查方法的完整 性。 • 通过对不同批次产品无菌检查的比较，对医用即无菌产品的生产全过程 进行质量监控。 • 3.3验证范围 • “所有无菌产品”的无菌检查。
• 3.4验证条件 • 3.4.1验证用菌株 • 金黄色葡萄球菌 • 菌种传代次数铜绿假单胞菌 • 枯草芽孢杆菌 • 生孢梭菌 • 白色念珠菌
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
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琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]