氧糖剥夺机制的研究进展
氧糖剥夺上调活性氧介导SH-SY5Y细胞Parthanatos死亡
氧糖剥夺上调活性氧介导SH-SY5Y细胞Parthanatos死亡郭文旭;张忠敏;关亚新【摘要】目的应用体外模型诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧糖剥夺(OGD),探讨神经元在缺血性损伤中的潜在机制.方法应用糖氧剥夺模型及SH-SY5Y细胞进行OGD处理,时间设为0h、12h及24h,应用活性氧(ROS)检测试剂盒检测各组细胞中ROS水平;使用MTT法检测各组细胞的生存率;Western Blotting检测各组细胞中凋亡诱导因子(AIF)蛋白、多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP1)蛋白及PAR蛋白的表达变化;使用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞中线粒体内膜电位变化.结果随着OGD时间的延长,MTT检测SH-SY5Y细胞的生存率逐渐降低(P<0.05);Western Blotting检测显示OGD明显增加了细胞中AIF蛋白、PARP1蛋白及PAR蛋白的表达水平(P<0.05);JC-1检测显示随着OGD作用时间的延长,线粒体膜电位逐渐降低;在使用抗氧化抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NEC)后,SH-SY5Y 细胞中AIF蛋白、PARP1蛋白及PAR蛋白表达量明显降低,且细胞生存率也显著提高(P<0.05).结论氧糖剥夺通过上调ROS水平介导SH-SY5Y细胞Parthanatos 死亡.【期刊名称】《牡丹江医学院学报》【年(卷),期】2019(040)003【总页数】4页(P1-4)【关键词】氧糖剥夺;活性氧;线粒体;Parthanatos【作者】郭文旭;张忠敏;关亚新【作者单位】牡丹江医学院附属红旗医院神经内三科,黑龙江牡丹江 157011;牡丹江医学院附属红旗医院神经内三科,黑龙江牡丹江 157011;牡丹江医学院附属红旗医院神经内三科,黑龙江牡丹江 157011【正文语种】中文【中图分类】R285缺血性脑卒中是导致成年人死亡和长期残疾的主要原因之一[1-2]，约占所用卒中患者的87%[3]。
藁本内酯抑制氧糖剥夺再灌注损伤神经元凋亡的机制
藁本内酯抑制氧糖剥夺再灌注损伤神经元凋亡的机制来自中国医科大学附属盛京医院的毕国荣团队最新研究发现，在体外培养PC12细胞模拟神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤的模型中，自噬激活可以抑制氧糖剥夺再灌注诱导的细胞凋亡。
藁本内酯是当归、川芎等传统中药的主要有效成分之一。
在氧糖剥夺再灌注诱导的PC12细胞凋亡中，藁本内酯可通过激活自噬抑制凋亡起到细胞保护作用。
缺血性脑血管疾病具有高致残率和高致死率的特点。
目前针对缺血的标准治疗是快速实现再灌注，但是，缺血再灌注损伤会加重组织损伤。
因此，需要针对缺血再灌注损伤探索新的靶分子进而开展新的治疗策略。
自噬是细胞在应激情况下所做出的一种非损伤性应答反应。
当受到各种生理或病理刺激因子的作用时，自噬介导的降解反应对稳定细胞形态和结构，对维持细胞正常功能具有重要意义。
此外，自噬缺陷可导致细胞碎片不能被及时清除，继而诱导细胞凋亡。
既往研究证实，可通过阻止线粒体自噬发挥拮抗细胞凋亡的作用。
因此，以自噬调控作为潜在靶点对缺血脑血管疾病治疗具有重要意义。
此次，毕国荣等的实验发现，藁本内酯能够抑制氧糖剥夺再灌注诱导的PC12细胞凋亡。
首先发现，藁本内酯可以通过增加Bcl-2，抑制Bax表达抑制氧糖剥夺再灌注诱导的PC12细胞凋亡。
此外，藁本内酯的这种抗细胞凋亡保护作用，可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制，说明藁本内酯可能通过调节自噬阴性细胞凋亡。
同时还发现藁本内酯可以上调自噬相关蛋白LC3-II以及p-LKB1和p-AMPK 的表达水平，并通过激活LKB1-AMPK-mTOR通路调节自噬，抑制凋亡发挥对氧糖剥夺再灌注诱导的细胞损伤保护作用，说明藁本内酯是治疗神经系统缺血再灌注损伤的潜在药物。
文章发表在《中国神经再生研究（英文版）》杂志2020年3期。
文章摘要：最近的研究证实自噬对脑损伤具有一定的保护作用，藁本内酯是一种从传统中药川芎中分离出来的生物活性物质，具有保护神经细胞的药理作用，但是藁本内酯的神经保护作用是否通过影响细胞自噬的机制而发挥，目前尚不清楚。
大鼠皮层小胶质细胞氧糖剥夺模型的制备
24中外医疗 CH IN A F OR EI G N ME DI C AL T R EA TM EN T基 础 医 学短暂的轻度缺血即可导致中枢神经系统损伤,小胶质细胞是中枢神经系统内免疫感受和效应细胞[1],对保护脑组织有重要作用。
本实验采用体外氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型来模拟脑损伤过程,为研究缺血过程中小胶质细胞的脑保护作用提供了可靠、实用的方法。
1 材料与方法1.1 实验动物出生1～2d Wistar大鼠。
购自吉林大学中心实验室。
1.2 实验方法1.2.1 大鼠皮层小胶质细胞原代培养和鉴定 采用酶消化法结合机械分离法进行培养[2]。
应用倒置显微镜观察不同时期细胞形态及生长情况。
在培养第8天用OX42免疫细胞化学染色进行鉴定。
1.2.2 制备小胶质细胞O G D 模型及评价 (1)缺氧D -Hank’s液的制备及缺氧罐的制作。
方法同前期研究[3]。
(2)小胶质细胞O G D 模型的建立及L D H 漏出率测定。
用缺氧D -H a n k ’s 液洗涤并孵育培养至第8天的小胶质细胞,在缺氧罐中37℃培养;取缺氧时间为30、60、120、180m i n 再复氧24h 的细胞检测L D H 漏出率,方法按说明书进行。
1.3 统计学分析结果以(x -±s )表示,采用方差分析,SPSS 15.0软件。
2 结果2.1 小胶质细胞原代培养及鉴定小胶质细胞在培养第8天分化成熟,OX42阳性细胞百分比为(97.33±2.15)%。
2.2 小胶质细胞OGD模型制备及评价血气分析仪测量缺氧D-Hank’s液氧浓度＜1%,抽成真空及通入缺氧气体后缺氧罐内氧含量为(1±0.1)%,二氧化碳浓度为(5±0.1)%。
小胶质细胞L D H 漏出率随缺氧时间延长逐渐增加,OGD60min之后与30min比较LDH漏出率有统计学差异,见表1。
氧糖剥夺(OGD)诱导SH-SY5Y细胞自噬性死亡
已贴壁的细胞更换为Байду номын сангаас血清，无糖培养基，然后，放入缺氧培养装 置中并充入已配好的 5%CO2 和 95%N2 组成的混合气体，并置于 37℃的恒温孵箱中 24 小时。 1.6 Western blotting 法检测各组细胞中相关蛋白的变化
使用 1500 转 / 分钟收集各组细胞，并使用 PBS 清洗两次，依 照细胞的数量加入细胞裂解液于冰上裂解半小时，使用 BCA 法测 量并调平蛋白浓度，加入 5× 上样缓冲液 100℃煮沸 10 分钟并于 4℃保存。将等量的蛋白质在 8% 聚丙烯酰胺 (SDS) 凝胶上电泳 并转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜 (Millipore, Billerica, MA, 美国 ) ， 并与 5% 的脱脂奶粉于室温孵育 2 小时，剪切相应的蛋白条带孵 育 抗 LC3（1：1000）、抗 ULK1（1：1000）、抗 P-ULK1（1：1000） 于 4℃冰箱过夜，次日，PBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟，然后将免疫 印迹膜与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠（1：2000）或抗兔 IgG（1： 2000）在室温下孵育 2 小时。最后使用 ECL 进行曝光显影。 1.7 统计分析
0 引言
缺血性卒中是脑血管疾病最常见的病种（60%-80%）[1]，具有 高发病率、高致死率的特点；其特征主要是血流中断和脑细胞的氧 气 / 葡萄糖缺乏，从而导致脑神经细胞功能障碍。而溶栓治疗是 目前治疗急性缺血性卒中的主要方法 [2]。然而，由于治疗时间窗 口狭窄和继发性脑损伤，如血脑屏障破坏，出血性转化和大量脑水 肿，成功的再灌注治疗在临床上是很有限的 [3]。脑梗死急性期溶 栓适应症及时间窗的限制，只有 2%-5% 的中风患者可以接受 tPA 治疗，其中只有 50％的患者能成功取得再灌注 [4]，此外，tPA 干预 增加了脑内出血的风险 [5] 和再灌注损伤 [6]。因此开发新疗法的需 求日益迫切。
氧糖剥夺对体外培养大鼠星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及机制
华 中科 技 大 学 学 报 （ 医学 版 ）
Ａｃ ａ Ｍ ｅ ｉ ｃ ｃ ｏ ｔ ｄ Ｕｎ ｖ Ｓ ｉＴｅ ｈｎ ｌＨｕａ ｈｏ ｚ ｎｇ
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氧糖 剥 夺 对 体 外 培 养 大 鼠星 形 胶 质 细 胞 内 Ｃ ｈ ｄｌ 蛋 白表 达 的影 响及 机 制 ＊
邱 瑾 ， 姚 文 龙 ， 张 明 ， 邹 妲 婧 ， 燕 琳 ， 张 传 汉 △
华 中 科 技 大 学 同 济 医 学 院 附 属 同济 医 院麻 醉 科 ， 武汉
环状RNA has_circ_0067923促进氧糖剥夺所致SH-SY5Y细胞凋亡的作用机制研究
而 ，这 些 治 疗 方 式 由 于 治 疗 时 间 窗 狭 窄 ，出 血 风 险
1.2.3 SH-SY5Y 细胞 OGD 模型构建 取处于对
等因素[2]，导致治疗效果并不理想。因此，深入了解 数生长期的 SH-SY5Y 细胞，按照 1×104 cells/mL 的细
缺血性脑卒中的发病机制，研发新的治疗手段，具 胞量传于 6 孔板，构建 OGD 模型：首先弃去原有培养
Hainan Med J, Jun. 2021, Vol. 32, No. 12
doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2021.12.001
海南医学 2021 年 6 月第 32 卷第 12 期
·论著·
环状 RNA has_circ_0067923 促进氧糖剥夺所致 SH-SY5Y 细胞凋亡的作用机制研究
【关键词】 环状 RNA；细胞凋亡；缺血性脑卒中；氧糖剥夺；细胞增殖；非编码 RNA 【中图分类号】 R329.2+1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1003—6350（2021）12—1497—06
Mechanism of has_circ_0067923 in promoting SH-SY5Y cell apoptosis induced by oxygen-glucose deprivation. WU Guan-jin 1, YAN Fu-ling 2, LIU Chen 3, ZHANG Chuan 1, QIN Shu-qiao 1, FENG Jing-jing 1, HEI Dan-dan 1. 1. Zhengzhou Yihe Hospital Affilliated to Henan University, Zhengzhou 450047, Henan, CHINA; 2. Department of Neurology, Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, CHINA; 3. Infection Management Office, People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450000, Henan, CHINA
氧糖剥夺刺激相关蛋白AnnexinA6与钾离子通道蛋白KCNQ2的相互作用研究
摘要脑卒中是一种脑血液循环障碍性疾病，主要是由于脑血管被血栓堵塞，导致大脑的长期供氧不足以及营养物质的缺失，引发细胞的能量代谢紊乱、离子失衡以及激活胞内多种信号通路，导致细胞的损伤或死亡。
目前有效的药物治疗主要局限在tPA对血栓的溶解来缓解病情，所以探究大脑缺血引发的细胞损伤机制以及制定相应的干预策略缓解大脑损伤对临床治疗和新药开发有重大的意义。
为了寻找参与脑缺血进程的蛋白，本研究将原代培养神经元进行氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation, OGD）刺激实验，体外模拟脑缺血进程。
提取全蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳和考染，对差异条带进行质谱分析鉴定出膜联蛋白VI（Annexin A6）。
Annexin A6属于Ca2+依赖性膜和磷脂结合蛋白家族，参与质膜修复、细胞凋亡进程、钙离子结合、肌肉收缩等生理过程。
神经元OGD刺激后，免疫印迹和免疫荧光结果均表明Annexin A6表达呈现下调趋势。
结合生物信息学在线分析，Annexin A6与KCNQ2可能存在相互作用。
免疫共沉淀和GST pull down证实以上预测，Ca2+存在增强Annexin A6与KCNQ2的相互作用，鳌合钙离子显著降低两者的结合。
通过对Annexin A6进行结构域截短突变，免疫共沉淀寻找Annexin A6与KCNQ2相互作用的结构域，结果显示Annexin A6删除N端核心区后，蛋白间相互作用最弱。
KCNQ2是K+通道蛋白，在维持神经元的电兴奋以及突触的传输中发挥重要作用。
KCNQ2的207和213位精氨酸突变会导致离子通道功能的异常，同时这两个位点是高度保守的，通过对这两个位点进行点突变来观察蛋白相互作用的变化，结果显示207位点突变不影响蛋白的互作，而当213位精氨酸突变为谷氨酰胺，蛋白的相互作用减弱。
综上所述，本研究利用原代培养神经元OGD刺激实验，借助质谱鉴定出Annexin A6。
OGD刺激导致Annexin A6表达下调，通过免疫共沉淀鉴定Annexin A6与KCNQ2存在相互作用。
二氯乙酸钠对氧糖剥夺损伤的BV2细胞的保护作用及其机制研究
二氯乙酸钠对氧糖剥夺损伤的BV2细胞的保护作用及其机制研究赵辉;章越凡;李铁军【摘要】目的研究二氯乙酸钠(dichloroacetate,DCA)对氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)损伤模型中小鼠小胶质细胞(BV2细胞)的保护作用,并探讨其作用机制.方法将BV2细胞分为3组:对照组、OGD组、DCA治疗组,通过OGD 4 h建立损伤模型.CCK-8和流式细胞仪检测细胞凋亡及ROS和NO的表达,Western blot检测NF-κB通路相关蛋白表达水平.结果 CCK-8及流式细胞检测结果表明,DCA可显著降低OGD诱导的BV2细胞凋亡,并且减少OGD后细胞中活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的表达(P<0.05).Western blot结果显示,DCA可显著影响OGD损伤介导的BV2细胞JNK、I-κB和NF-κB蛋白表达水平(P<0.05).结论 DCA对OGD损伤的BV2细胞具有保护作用,其机制与抗凋亡、抗氧化和抗炎作用有关.【期刊名称】《药学实践杂志》【年(卷),期】2019(037)002【总页数】5页(P146-150)【关键词】二氯乙酸钠;氧糖剥夺;ROS;NF-κB【作者】赵辉;章越凡;李铁军【作者单位】安徽中医药大学药学院 ,安徽合肥 230012;海军军医大学药学院药理学教研室,上海200433;安徽中医药大学药学院 ,安徽合肥 230012;上海市浦东新区浦南医院药剂科,上海 200125【正文语种】中文【中图分类】R966缺血性卒中是一种常见的神经系统性疾病，是导致死亡的主要原因[1]。
胶质细胞是脑内的天然免疫效应细胞，参与一系列神经退行性病变[2]。
活化的小胶质细胞释放促炎因子以及细胞毒性因子(如NO和ROS)，导致神经元损伤[3]。
研究表明，小胶质细胞激活诱发的炎症反应参与了脑卒中的损伤过程[4]。
二氯乙酸钠(DCA)是一种可口服吸收的小分子化合物，临床上可用于治疗线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)综合征、先天性乳酸性酸中毒和其他疾病的儿童[5]。
氧糖剥夺条件下神经细胞损伤机制研究进展
李珊珊 白美玲 河北北方学院基础医学院，【摘要】氧糖剥夺下的损伤，是在细胞层面上模拟缺血胞组成，缺血缺氧后细胞会产生坏死、果，最终导致神经功能受损。
兴奋性氨基酸增多、条件下神经细胞损伤机制研究进展进行综述。
【关键词】氧糖剥夺；【中图分类号】潜、封闭作业等极端环境或者突发疾病（如中风、休克）会使大脑长时间暴露在缺血、缺氧状态下，从而造成脑缺血，导致神经细胞损伤和死亡，使神经系统和大脑功能产生难以逆转的损伤。
在缺血、缺氧状态下，大脑中的氧化与抗氧化能力出现了严重的失衡，进而引起了机体的氧化应激损伤。
脑缺血是造成脑损伤最重要和危及生命的原因之一。
1.1 中风（脑血管疾病）中风（cerebrovascular insult，CVI）被定义为一种神经病理学实体，中风会发生在向大脑提供氧气和必需营养物质（如葡萄糖以及某些生物活性分子）的血流受到部分或全部干扰时［2-3］。
中风后会导致大脑组织供血不足，从而导致大脑缺血缺氧，从而导致失语、偏瘫等，其是由多种原因引起的［4］。
在中风等急性神经疾病中，中枢神经系统会受到严重损伤，中风成为死亡和残疾的第二大原因［5］。
成年哺乳动物中枢神经系统中的神经元因中风而受损，通常会导致衰竭或再生轴突的能力有限，从而导致感觉、运动或认知功能的长期残疾［6］。
越来越多的证据表明，中风背后的生物过程是由神经元、神经胶质、血管细胞和基质成分的相互作用驱动的［7］。
中风引起的氧和葡萄糖缺乏导致线粒体功能障碍，进一步加剧氧化应激、炎症和神经元死亡，同时削弱氧化代谢［8］。
1.2 OGD模型氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）模型能够模拟整体水平脑缺血损伤，因此广泛用于研究体外水平脑缺血损伤，并且普遍作为体外水平评价药物神经保护作用的有效手段［9］。
离体模型防止了在体模型中干扰因素，如神经、体液等的影响，相比在体模型能更清晰地在细胞和分子水平反映损伤机制，易于发现新的治疗靶点［10］，因此OGD模型被认为是研究脑缺血性损伤的在体外水平的重要手段之一。
铁皮石斛多糖对氧糖剥夺再灌注损伤的影响及机制探讨
铁皮石斛多糖对氧糖剥夺再灌注损伤的影响及机制探讨【摘要】：目的：探索铁皮石斛多糖（DOP）对氧糖剥夺再灌注（OGD/R）损害的影响及其机理研究。
方法：通过建立氧糖剥夺再灌注OGD/R损伤模型，模拟体外神经细胞缺血-再灌注损伤模型。
在此基础上，设立不同浓度DOP浓度（15、30、60 μg /ml ）组。
于细胞培养24h后，通过CCK-8技术对各组细胞活力进行检测；通过qPCR和Western blot技术对细胞凋亡相关因子（p53、caspase-3、BAX、Bcl-2）的表达进行检测，并从细胞形态学观察细胞凋亡情况。
结果：与正常培养组相比，神经细胞经OGD/R环境处理后大量死亡（P＜0.05），表现为细胞活力显著降低，促凋亡相关基因（p53、caspase-3、BAX）显著增加，而抗凋亡相关基因Bcl-2显著减少，神经细胞的胞体和突起明显缩短，核深染细胞数量显著增加。
但细胞凋亡状况经不同浓度DOP干预后显著改善（P＜0.05）。
结论：铁皮石斛多糖能缓解由氧糖剥夺再灌注（OGD/R）破坏造成的细胞凋亡。
关键词：铁皮石斛多糖；氧剥夺-再灌注损伤（OGD/R）；HT22细胞；凋亡前言：脑卒中严重威胁人类健康，世界卫生组织调查结果显示，从1990年到2019年，脑卒中的发病率逐年上升，新发病例和死亡病例几乎翻一番，已成为造成国民死亡原因的首位危险因素。
在幸存的患者中，脑梗死居大多数。
其中3/4的存活者患有不同程度的残疾，这给家庭、国家和社会医疗资源带来了巨大的压力。
铁皮石斛（DOP）作为我国名贵中药材，以多糖为主要成分，具备抗氧化、抗炎和增强免疫力等多种生物活性[1-3]。
近期研究表明铁皮石斛多糖可抑制神经细胞凋亡[4-5]，本课题前期体内研究发现，由脑缺血-再灌注损伤引起的细胞凋亡可由DOP缓解；但它的作用在体外并没有得到直观且系统的研究[6]。
为此，本试验通过建立氧糖剥夺-再灌注损伤（OGD/R）模型来观察DOP对细胞凋亡的作用。
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氧糖剥夺机制的研究进展缺血性脑病(ischemic brain disease)又称缺血性中风，目前已成为全球范围内主要致死、致残的疾病之一，严重威胁着人类的生命与健康[1,2]。
在近些年的研究中发现，脑缺血后有相当部分的血管能自然再通或经溶栓治疗后恢复再通，但随之而来的是进一步的脑损伤和功能障碍，即缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury）[3]。
有关脑缺血再灌注损伤发生机制的研究近年来进展很快，研究认为脑血流中断和再灌注导致的脑细胞损伤是一个多因素、多机制、快速的恶性级联反应。
这个级联反应包括许多环节，如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。
这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死[4]。
通过建立原代培养的大鼠海马神经元缺糖缺氧损伤模型，探讨药物对大鼠海马神经元氧糖剥夺后损伤的保护作用及可能的机制，其研究结果为脑缺血损伤的治疗提供基础理论和实验依据。
1.兴奋性氨基酸释放增加谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性[4]。
谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质之一。
正常情况下，Glu的释放、摄取和重吸收保持在动态平衡中，由于体内高效能Glu摄取系统（Glu转运体GLT-1）的存在，使细胞外的Glu维持在较低的水平，仅有少量作为兴奋性神经递质参与信号传导。
然而, 脑缺血后或氧和血糖供应不足时[5]，细胞外Glu蓄积，Glu大量堆积后，激活Glu受体，对海马神经元产生毒性作用。
就目前所知，脑内rhIL-6的中枢作用，除促进主要的免疫应答外，尚可促进星形胶质细胞增殖，刺激星形胶质细胞分泌神经生长因子，并对体外培养中枢神经元具有神经营养作用[6]。
丁爱石等报道[7]，低氧预处理组神经元缺氧后rhIL-6免疫反应神经元的平均光密度均明显高于对照组，rhIL-6可保护海马培养神经元对抗谷氨酸引起的细胞损伤。
2.钙离子超载低氧能引起神经细胞出现兴奋性氨基酸毒性作用，导致突触前兴奋性氨基酸大量释放，过度激活突触后电压依赖性NMDA 受体门控通道，引起细胞外Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2 +超载[8]。
神经元内的钙离子超载引起的损伤的可能机制包括：①胞内Ca2+浓度异常增加，触发Ca2+依赖的级联反应，如Ca2+依赖的蛋白激酶、磷脂酶、蛋白酶、nNos、核酸内切酶的激活，直接损伤靶细胞或产生细胞毒性物质，如自由基等，最终导致神经细胞的损伤和死亡；②线粒体内钙离子超载，钙离子抑制ATP合成，最终使线粒体通透性转换孔(肿)呈高通透状态，线粒体肿胀破坏，细胞能量耗竭，同时触发其释放大量钙离子，致使细胞内超过承受钙离子的限度时，可使多种酶激活，细胞功能紊乱，死亡；③钙离子增加可能诱发细胞凋亡，一些可以轻度提高钙离子浓度的物质如谷氨酸受体激活剂，在使钙离子升高的水平低于可引起细胞坏死时即可诱导细胞凋亡[9]。
3.ATP生成减少线粒体钙离子的过载可造成线粒体内膜上可透性转运孔的开放，使H+的化学性电位消失， ATP的生成受阻，随着能量的耗竭，膜电位的消失，神经元发生去极化，去极化之后，兴奋性氨基酸，尤其是谷氨酸，从突触前神经元大量释放至胞外，该事件发生在缺血极早期。
除谷氨酸对神经元大量产生直接兴奋性毒性损伤外，谷氨酸受体NMDA、AMPA的激活引起了胞内钙、钠和氯的增加，因此增加了脑水肿的程度和由胞内过度升高的钙离子引起的毒性。
兴奋性毒性不但可以引起坏死而且还可以启动凋亡分子事件的发生。
因此，ATP产生减少可致细胞死亡[10]。
4.调亡基因激活与基因表达的保护作用4.1 细胞色素C细胞色素C 从线粒体中释放到细胞浆，与凋亡相关因子1 （Apaf- 1）结合后形成多聚体[11]，释放的cyt C 与Apaf- 1 的结合可导致下游的caspase（半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）的活化或解除一种内在的抑制机制。
Apaf- 1 的氨基末端组成一个caspase 募集区，它可能直接结合于caspase 9。
被激活的caspase- 9 能激活其它的caspase 如caspase- 3 等，从而诱导细胞凋亡。
另外细胞色素C 还可以直接作用于细胞核引起细胞凋亡。
很显然，细胞色素C 从线粒体释放是细胞凋亡的关键环节。
4.2 HO-1的表达脑内血红素氧合酶（HO）系统是一个微粒体酶系统,在人和哺乳动物体内广泛存在,涉及整个生长发育过程,参与多种生理和病理过程, 是血红素降解起始酶和最为重要的限速酶[12]。
HO-1是目前已知最易受诱导的酶，提示HO- 1是脑细胞对抗氧化应激反应的重要组成部分，有研究发现HO- 1 被激活后能够影响某些凋亡因子。
王雁等研究发现，使用血晶素诱导海马神经元HO-1的表达，氧糖剥夺损伤后神经元细胞色素C降低，Apaf-1和caspase-3也降低，神经元存活率增加、凋亡率降低。
表明，HO- 1 对神经元的保护作用与抑制细胞色素C 的释放有关。
由于抑制细胞色素C 的释放，有效的抑制了细胞色素C 引起细胞凋亡的起始关键因子Apaf- 1，进而线粒体细胞色素C 释放引起凋亡的通路就被抑制。
赵国良等[13]研究发现丙泊酚诱导氧糖剥夺海马神经元表达HO-1进而上调Bcl-2从而抑制氧糖剥夺体外培养海马神经元的凋亡，可能是丙泊酚神经保护作用的机制之一。
HO-1被激活后能够通过分解血红素生成的代谢产物和影响某些凋亡因子而抑制缺血/再灌注损伤引起的细胞损伤和凋亡，具有明显的细胞保护作用。
但HO-1对细胞凋亡的调节是否具有细胞特异性,其防御凋亡的具体机制是什么,目前尚未明确,需要作进一步的研究。
4.3 Bcl-2的表达抗凋亡蛋白Bcl-2 是Bcl-2 蛋白家簇中的一员,定位于线粒体、内质网和完整的核周膜。
细胞凋亡受到Bal-2基因家族的调控，对细胞色素C具有明显的调控效应[14]。
Bal-2蛋白需通过与Bax形成异源二聚体来抑制凋亡。
随着Bcl-2 蛋白表达上调, 越来越多的Bax 同源二聚体分离, 与Bcl-2蛋白形成Bax-Bcl-2异源二聚体,从而抑制Bax-Bax 同源二聚体形成, 抑制凋亡。
动物实验证实, 丁苯酞软胶囊可升高Bcl-2蛋白表达, 降低Caspase-3的表达, 减少大鼠局灶性脑缺血后神经元损伤, 减小梗死体积[ 15]。
在HO-1表达上调的细胞中Bcl-2明显增加,而HO-1抑制剂锌原卟啉( ZnPP)可抑制Bcl-2 的表达。
Panahian等[16]发现HO-1能上调Bcl-2蛋白和抑制p53蛋白核内聚集。
5.自由基的产生氧化自由基在酶转化过程中产生。
线粒体渗透转移孔在氧糖剥夺后形成并开放，导致氧化自由基的爆发性增多和促凋亡分子的释放。
自由基能引起氧化反应、膜损伤、细胞进程的失调、染色体的变异。
事实上，活性氧簇可以损伤细胞各成分[17]。
细胞损伤造成了离子稳态，细胞信号和基因表达的紊乱。
氧化自由基作为重要的信号分子启动凋亡反应。
缺血缺氧条件下，神经元存活率大大降低，乳酸脱氢酶（LDH）检测发现培养细胞上清液中LDH含量增加，说明神经元在缺血缺氧情况下，胞膜的完整性受到损伤，导致LDH大量外漏，这可能与缺血缺氧导致胞膜发生脂质过氧化相关。
结合文献报道的缺血缺氧导致神经元凋亡，我们认为缺血缺氧导致的神经元死亡既有坏死又有凋亡。
郑龙等[18]研究发现黄芪可以减轻缺血缺氧所导致的LDH漏出，说明黄芪可通过对抗脂质过氧化等胞膜损伤因素而保护神经元。
脑源性生长因子（BDNF）在缺血缺氧损伤的情况下，神经元对其的表达明显下调，而加入黄芪保护后其表达明显回升，这一结果表明,黄芪对抗缺血缺氧损伤与BDNF的关系密切[19]。
黄芪可能通过某种机制阻断缺血缺氧所引发的BDNF表达下调通路而发挥其神经保护作用。
这方面的机制尚有待进一步深入研究。
另外，黄芪还可增强Bcl-2蛋白的表达[20]，阻止脑组织SOD活性降低和MDA含量增加，具有抗脂质过氧化作用[21]。
6.结语缺血性脑损伤目前已成为一种临床常见的疾病，对其机制的研究一般分为在体和离体两种。
本篇文章是通过在体外建立一种氧糖剥夺模型来模拟在体的缺血缺氧模型，对缺血缺氧引起的损伤的机制已取得了一定的进展，但还有一些机制需进一步研究。
研究其相关机制，有望为治疗脑缺血等疾病提供新的理论依据。
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