目的基因的功能验证PPT课件
目的基因的功能验证
时间上的可控性
用可诱导的启动子调控Cre重组酶的表达 加入诱导物之后，启动子才具有活性
针对 DNA 上的 靶位点，根据其 两侧序列设计两 个锌指蛋白分子
CRISPR-Cas9
在CRISPR/Cas系 统里，短片段的 外源DNA分子转 录为crRNA,与 tracrRNA结合， 介导了序列特异 性的切割作用， 最后在Cas蛋白的 作用下使靶标基 因发生突变
空间上的可控（组织特异性敲除）
loxP位点：一段34碱基的特定DNA序列，具有方向性 Cre重组酶：介导loxP位点发生重组的酶
Cre-LoxP系统的基因敲除
1. 构建条件基因打靶小鼠：将靶基因两端锚定上同向的LoxP位点 2. 构建组织特异性Cre转基因鼠 3. 将上述两小鼠杂交，得到组织特异性基因敲除小鼠
反义RNA是指与 mRNA互补的RNA 分子，可直接与 mRNA形成双链 RNA。由于核糖体 不能翻译双链RNA， 所以反义RNA可抑 制该mRNA的翻译。
如何操作？？ 1. 向细胞内转化双链RNA分子（转化上的难度，不能稳定遗传） 2. 向细胞内转化DNA分子，转录后成为双链RNA 3. 将2个DNA分子（分别编码靶基因的正义链和反义链），分别 转入细胞 4. 较繁琐，如何只通过转化1个DNA分子，就能实现RNAi？
基因的过量表达（overexpression）
通过强启动子的驱动，使某一功能基因高于正常生 理水平表达，通过检测基因过表达后对某一性状和 表型造成的影响，来推测基因的功能。 单细胞
多细胞
在特定组 织中的 定时表达
头部
驱动目的基因在特定组织和细胞内的高效表达
目的基因的功能验证
减弱该基因在细胞内的作用 基因敲除 RNAi 增强该基因在细胞中的作用 基因的过量表达
目的基因.ppt
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
《目的基因的表达》PPT课件
➢ 包含体表达的优点
o 可以避免宿主的降解。 o 当以包含体表达时，目的基因产物的表达量也往往比较高， o 包含体容易纯化，往往仅通过简单的差速离心及洗涤等几步即可得到较
高纯度的目的蛋白。 o 当所表达的重组蛋白产物对宿主细胞具有毒性时，使重组目的产物以无
活性的包含体形式表达可能是蛋白表达的最佳方式。
一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径
为了在大肠杆菌中合成某种特殊的真核生物的蛋白质以满足商品生产 的广泛需求，仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的，所以，必须设 法提高克隆基因的表达效率。
许多因素诸如启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、 mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和 寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率，因 而从分析这些因素入手就能够寻找提高克隆基因表达效率的有效途径。
克隆基因末端的转录终止区的存在，可避免以下几种不利现象：
①若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大 量非必须的蛋白质；
②在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了 转译的效率；
③偶然会出现启动子阻塞现象，即克隆基因启动子所开始的转录干扰 另一个必要的基因或调节基因的转译。
第八章 目的基因的表达
第一节 基因工程中的基因表达
一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响
不论基因工程的研究目的如何，最终均涉及到目的基因的表达问 题。
绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。在构建重 组体DNA分子和选择宿主细胞时，还须考虑外源基因表达的问题。
基因功能验证流程
基因功能验证流程(中英文实用版)Title: Gene Function Validation Process基因功能验证流程是一个复杂而精细的科学过程，它的主要目的是通过实验手段确认特定基因在生物体中的功能和作用。
这一过程对于理解基因如何影响生物体的生理和病理过程至关重要。
The gene function validation process is a complex and delicate scientific endeavor.Its primary aim is to confirm the function and role of a specific gene in an organism through experimental means.This process is crucial for understanding how genes influence an organism"s physiological and pathological processes.验证基因功能的第一步通常是基因克隆，即将目标基因插入到适当的载体中，然后转入细胞中进行表达。
这一步骤的成功与否直接关系到后续功能验证实验的进行。
The first step in validating gene function is typically gene cloning, which involves inserting the target gene into an appropriate vector and then expressing it in cells.The success of this step directly affects the subsequent function validation experiments.接下来，研究者会进行一系列的生物化学和分子生物学实验，如Western blot、PCR等，来检测目标基因在细胞中的表达水平和活性。
【生物】6.2 基因工程及其应用 ppt课件1(必修2)
目的基因
目的基因
黏性末端
GAAT T CT T AAG
黏性末端
思考与讨论:
2、会产生几个黏性末端？
目的基因
基因的运载体
GAA TT C
GAA TT C
C TT AA G
C TT AA G
用同种限制酶切割
G AA TT C
G AA TT C
C TT AA G
97.有三个人是我的朋友爱我的人.恨我的人.以及对我冷漠的人。 爱我的人教我温柔；恨我的人教我谨慎；对我冷漠的人教我自立。――[J·E·丁格] 98.过去的事已经一去不复返。聪明的人是考虑现在和未来，根本无暇去想过去的事。――[英国哲学家培根] 99.真正的发现之旅不只是为了寻找全新的景色，也为了拥有全新的眼光。――[马塞尔·普劳斯特] 100.这个世界总是充满美好的事物，然而能看到这些美好事物的人，事实上是少之又少。――[罗丹] 101.称赞不但对人的感情，而且对人的理智也发生巨大的作用，在这种令人愉快的影响之下，我觉得更加聪明了，各种想法，以异常的速度接连涌入我的脑际。――[托尔斯泰] 102.人生过程的景观一直在变化，向前跨进，就看到与初始不同的景观，再上前去，又是另一番新的气候――。[叔本华] 103.为何我们如此汲汲于名利，如果一个人和他的同伴保持不一样的速度，或许他耳中听到的是不同的旋律，让他随他所听到的旋律走，无论快慢或远近。――[梭罗] 104.我们最容易不吝惜的是时间，而我们应该最担心的也是时间；因为没有时间的话，我们在世界上什么也不能做。――[威廉·彭] 105.人类的悲剧，就是想延长自己的寿命。我们往往只憧憬地平线那端的神奇【违禁词，被屏蔽】，而忘了去欣赏今天窗外正在盛开的玫瑰花。――[戴尔·卡内基] 106.休息并非无所事事，夏日炎炎时躺在树底下的草地，听着潺潺的水声，看着飘过的白云，亦非浪费时间。――[约翰·罗伯克] 107.没有人会只因年龄而衰老，我们是因放弃我们的理想而衰老。年龄会使皮肤老化，而放弃热情却会使灵魂老化。――[撒母耳·厄尔曼] 108.快乐和智能的区别在于：自认最快乐的人实际上就是最快乐的，但自认为最明智的人一般而言却是最愚蠢的。――[卡雷贝·C·科尔顿] 109.每个人皆有连自己都不清楚的潜在能力。无论是谁，在千钧一发之际，往往能轻易解决从前认为极不可能解决的事。――[戴尔·卡内基] 110.每天安静地坐十五分钟·倾听你的气息，感觉它，感觉你自己，并且试着什么都不想。――[艾瑞克·佛洛姆] 111.你知道何谓沮丧---就是你用一辈子工夫，在公司或任何领域里往上攀爬，却在抵达最高处的同时，发现自己爬错了墙头。－－[坎伯] 112.「伟大」这个名词未必非出现在规模很大的事情不可；生活中微小之处，照样可以伟大。――[布鲁克斯] 113.人生的目的有二：先是获得你想要的；然后是享受你所获得的。只有最明智的人类做到第二点。――[罗根·皮沙尔·史密斯] 114.要经常听.时常想.时时学习，才是真正的生活方式。对任何事既不抱希望，也不肯学习的人，没有生存的资格。
鉴定目的基因的方法
鉴定目的基因的方法一、序列比对和分析序列比对和分析是鉴定目的基因的首要步骤。
通过将目的基因的序列与已知序列进行比对，可以确定目的基因的种类、来源和可能的相似性。
常用的序列比对和分析方法包括BLAST、Smith-Waterman算法、FASTA等。
这些方法可以确定目的基因与已知基因或蛋白质序列的相似性，从而初步鉴定目的基因。
二、功能验证功能验证是鉴定目的基因的重要手段。
通过将目的基因在细胞或生物体中进行表达，观察其表达产物是否具有预期的功能，可以进一步确定目的基因的功能。
常用的功能验证方法包括基因敲除、基因过表达、基因编辑等。
这些方法可以改变目的基因的表达水平或表达产物，从而观察其对细胞或生物体的影响。
三、表达水平检测表达水平检测可以反映目的基因在特定条件下的表达情况。
通过检测目的基因在不同条件下的表达水平，可以了解目的基因的表达调控机制，以及其在生物体中的重要作用。
常用的表达水平检测方法包括qPCR、Western blot、RNA-seq等。
四、进化树构建进化树构建可以反映目的基因在物种间的进化关系。
通过比较不同物种间的目的基因序列，可以构建进化树，从而了解目的基因的进化历程和可能的起源。
五、分子标记辅助鉴定分子标记辅助鉴定可以利用特定的分子标记来辅助鉴定目的基因。
这些分子标记可以是限制性片段长度多态性（RFLP）、可变数目串联重复（VNTR）等。
通过检测目的基因是否存在这些分子标记，可以进一步确定目的基因的种类和来源。
六、基因敲除或过表达基因敲除或过表达是鉴定目的基因功能的重要手段。
通过构建突变体或转基因植株，使目的基因不能正常表达或过量表达，可以观察其对生物体表型的影响，从而了解目的基因的功能。
常用的敲除或过表达方法包括CRISPR-Cas9技术、转录因子诱捕等。
七、蛋白质功能鉴定蛋白质功能鉴定可以通过分析目的基因表达产物的生化性质和功能，进一步确定目的基因的功能。
常用的蛋白质功能鉴定方法包括亲和层析、质谱分析、结晶学分析等。
《目的基因的表达》课件
目的基因表达的机制
目的基因的表达是通过转录和翻译的过程实现的，同时也受到转录因子和后转录修饰的调控。 ## 1. 转录与翻译的过程 基因的信息首先通过转录过程转化为RNA，然后通过翻译过程合成蛋白质。 ## 2. 转录因子的作用 转录因子能够结合到目的基因的启动子区域，调控基因的转录过程。 ## 3. 后转录修饰的作用 通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式对RNA和蛋白质进行修饰，影响目的基因的重要活动之一，对于理解生物体的发育和生理功能具有重要意义。 ## 目的基因表达的重要性 目的基因的表达对生物体的正常生理功能起到关键作用。 ## 目的基因表达的未来研究方向 未来的研究将更加深入地探究目的基因的调控机制和应用前景。
参考文献
1. 张三, 李四. (2020) 目的基因表达的研究进展. 《生物科学》, 10(2), 123-135.
目的基因表达与疾病
目的基因的异常表达常常与各种遗传疾病和环境疾病的发生和发展密切相关。 ## 1. 目的基因表达与遗传疾病 目的基因的突变或缺失会导致遗传疾病的发生。 ## 2. 目的基因表达与环境疾病 环境因素的影响可能改变目的基因的表达水平，导致环境疾病的发生。
目的基因表达的应用
目的基因的表达在生物技术和临床医学领域有着广泛的应用。 ## 1. 生物技术领域的应用 目的基因的表达与基因工程、转基因技术等密切相关。 ## 2. 临床医学领域的应用 目的基因的表达研究为疾病的诊断、治疗和预防提供了重要的理论基础。
2. 王五, 赵六. (2021) 目的基因的功能及表达调控机制. 《遗传学报》, 15(3), 456-467.
《目的基因的表达》PPT 课件
# 目的基因的表达
基因的表达是指基因中的信息在生物体内转化成蛋白质或RNA的过程。了解目 的基因的表达机制对于研究基因功能和理解生物发育过程具有重要意义。
筛选标记和目的基因PPT课件
基因作为筛选标记基因遗传转化得到的转基因植株能够种植在重金
属污染的土壤中。
第7页adA) 双子叶植物叶绿体转化多采 用 aadA 基因， 用壮观霉素(spectinomycin)进行筛选， 获得同质 叶绿体转化细胞的筛选周期不同受体材料差异很大， 分化植株的前 期筛选一般 2 ～8 个月， 甜菜叶绿体转化筛选8 个月后才分化植株 。 棉花叶绿体转基因从枪击受体胚性愈伤到获得同质叶绿体转基因植 株则长达 18 个月 。单子叶禾本科植物对壮观霉素具有天然抗性， 因此， 水稻叶绿体转化时 aadA 基因的筛选采用链霉素， 链霉素的 作用机理主要抑制非转化细胞分化绿苗和根的形成， 愈伤组织阶段 筛选效果很不明显， 后期分化绿苗以及生根阶段效果才体现出来， 其作为禾本科作物的筛选标记， 效果并不理想。
第13页/共20页
1.4 荧光蛋白基因 荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质
量为 20~30 kD 的同源性蛋白，包括绿色、 红色、 黄色和青色荧 光蛋白等。 绿色荧光蛋白 （GFP ） 是其中应用的最多的一种，最 初是从维多利亚发光水母 （Aequorea victoria ） 中分离得到. 下 村修在研究水母的发光机制时发现腔肠素 （coalenterazine ） 和 钙离子与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白发蓝色荧光，同时激 发 GFP，使其发绿色荧光GFP 是一条由 238 个氨基酸所组成的单 体蛋白，相对分子质量为 27kD，用 395 nm 的紫外光和 475 nm 的蓝光激发， 可在 508 nm 处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物.
第18页/共20页
2.3 报告基因在微生物学研究中的应用 生物环境工程研究的重要工具. 微生物环境工程研究中使用的报告 基因有对有毒化学物质苯喃 （Benzofurans ） 响应的 SOS 细胞分 离抑制基因 ，钴离子诱导的半乳糖苷酶基因和钙离子调节的荧光素 酶基因等。操纵子参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌的硫氧化代谢过程，并 通过特异性调控蛋白对底物 Na 2 S 2 O 3 的诱导作用产生响应 . 作为一种简便有效的方法，报告基因在微生物检测和调控研究中正 发挥着越来越重要的作用.
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
授课：XXX
11
反义RNA是指与 mRNA互补的RNA 分子，可直接与 mRNA形成双链 RNA。由于核糖体 不能翻译双链RNA， 所以反义RNA可抑 制该mRNA的翻译。
2021/3/9
授课：XXX
12
如何操作？？ 1. 向细胞内转化双链RNA分子（转化上的难度，不能稳定遗传） 2. 向细胞内转化DNA分子，转录后成为双链RNA 3. 将2个DNA分子（分别编码靶基因的正义链和反义链），分别 转入细胞 4. 较繁琐，如何只通过转化1个DNA分子，就能实现RNAi？
目的基因的 功能验证
2021/3/9
授课：XXX
1
基于同源重组的方法
2021/3/9
授课：XXX
2
针对单细胞 微生物 小鼠
2021/3/9
授课：XXX
3
正负双向筛选法
正选择标记 抗生素抗性基因
负选择标记 致死基因tk 将无毒的核酸类 似物（GANC） 转变为毒性物质
2021/3/9
授课：XXX
4
完全基因敲除的弊端
基因完全失活，对于看家基因来说，该 基因缺失的突变往往具有致死效应，突 变体不易存活
改进：条件基因敲除，实现基因敲除在 空间和时间上的可控性
2021/3/9
授课：XXX
5
空间上的可控（组织特异性敲除）
loxP位点：一段34碱基的特定DNA序列，具有方向性 Cre重组酶：介导loxP位点发生重组的酶
2021/3/9
授课：XXX
13
基因的过量表达（overexpression）
通过强启动子的驱动，使某一功能基因高于正常生 理水平表达，通过检测基因过表达后对某一性状和 表型造成的影响，来推测基因的功能。
单细胞 多细胞
在特定组 织中的 定时表达
2021/3/9
授课：XXX
14
2021/3/9
头部
2021/3/9
授课：XXX
6
Cre-LoxP系统的基因敲除
2021/3/9
授课：XXX
7
1. 构建条件基因打靶小鼠：将靶基因两端锚定上同向的LoxP位点 2. 构建组织特异性Cre转基因鼠 3. 将上述两小鼠杂交，得到组织特异性基XX
8
时间上的可控性
用可诱导的启动子调控Cre重组酶的表达 加入诱导物之后，启动子才具有活性
驱动目的基因在特定组织和细胞内的高效表达
授课：XXX
15
2021/3/9
授课：XXX
16
刚才的发言，如 有不当之处请多指
正。谢谢大家！
2021/3/9
17
2021/3/9
授课：XXX
9
针对 DNA 上的 靶位点，根据其 两侧序列设计两 个锌指蛋白分子
2021/3/9
授课：XXX
10
2021/3/9
CRISPR-Cas9
在CRISPR/Cas 系统里，短片段 的外源DNA分子 转录为crRNA,与 tracrRNA结合， 介导了序列特异 性的切割作用， 最后在Cas蛋白 的作用下使靶标 基因发生突变