裸鼠成瘤ppt课件
肿瘤的实验动物和细胞研究技术 ppt课件
Culture Repositories, Institute for Medical Research, Camden, NJ)
ppt课件
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6. 其他特性：
(a) 分泌激素和异位激素: 绒毛膜癌→HCG 垂体瘤→生长激素 肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌→ACTH 人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）→促性腺激素 肝癌→HCG
(b) 肿瘤细胞的受体表达: ER PR AR (c) 酶及同工酶活性:
酶活性保持(HTC→酪氨酸氨基转移酶)、变化 诱导剂 糖皮质激素、多肽激素
肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约7～10天传代一次） 半年以上,生长稳定, 并能保持肿瘤细胞的特性， 称为肿瘤细胞系(cell line)
肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性 的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cell strain), 细胞具有 相同的基因型和表型(单克隆)
Flow Laboratories; GIBCO
ppt课件
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特殊表型肿瘤细胞系（株）：
高转移 人肝细胞性肝癌细胞株MHCC97 人黑色素瘤细胞株MV3、 卵巢癌细胞株HO-8910PM、 肺巨细胞癌细胞株PGBE1
高度耐药 人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增114.7倍
分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子 人肺小细胞癌细胞株LU-165→抗利尿激素; 人肺腺癌细胞株LC-2/ad→α1-抗胰蛋白酶 人红白血病细胞株K562高表达端粒酶
肝胆胰脾裸鼠皮下成瘤及原位瘤动物实验方案
裸鼠皮下成瘤及原位瘤动物实验方案分组:正常细胞组、EGFR1转染无关siRNA组、EGFR1转染目的基因（每组6只）。
细胞准备及注射裸鼠方法：到动物室准备实验。
取出未作处理的小鼠和处理后小鼠用鼠笼，顺序摆放在超净台中。
选体形较大的小鼠称重，以3μl/g剂量，腹腔注射10％水合氯醛麻醉小鼠。
约5分钟，小鼠开始进入安静状态，将其仰卧固定。
切忌麻醉剂过量使用。
(1)铺白布于鼠板上，仰卧位固定小鼠四爪，碘伏棉球消毒腹侧面上至颈部、下至腹股沟、后至腋后线。
消毒两次。
铺手术巾于小鼠上，在其左侧剪口（4*4cm），暴露其左侧腹部, 用碘伏消毒一次。
在左侧肋弓下缘1cm处向下剪开2cm皮肤，暴露腹壁肌肉，镊子牵拉腹壁肌肉，避开腹腔内脾脏，剪开腹壁肌肉，暴露内脏。
用棉签蘸PBS，拨出脾脏下极，切忌牵拉，以免损伤脾脏和胰腺。
(2)找到脾脏同时，用25微升Matrigel混合于细胞管中，打悬细胞沉淀，使细胞分散均匀成单细胞悬液。
用BD针吸净EP管中的单细胞悬液，稍退针芯，打出气泡，在脾脏下极内侧（凹面）进针向脾门方向约2mm开始注射细胞，注射完毕停留约30秒钟，缓慢退出针，以防细胞渗出。
同时用蘸PBS的棉球压迫周围出血点止血。
(3)用注射器吸取庆大霉素注射液（用生理盐水250：1稀释）约400微升，注入腹腔，棉球蘸干皮缘渗出的抗生素。
开始缝合腹壁肌肉（连续缝合4针）。
再次用注射器吸取庆大霉素注射液约400微升冲洗缝合口，棉球蘸干。
缝合皮肤（间断缝合4针）。
碘伏棉球消毒缝合口。
撤除固定，使小鼠处于自然体位，放于鼠笼中。
(4)所有细胞注射完毕，剪耳标记，记录剪耳标记及分组情况。
Day5-7：注意小鼠的状态，及时发现小鼠是否有因手术刺激、胰腺损伤、感染等死亡的情况。
Day42：颈椎离断，处死小鼠，解剖尸体，观察脾脏肿瘤生长状况，肝脏、肺脏及其他器官是否有转移瘤形成。
所有可疑组织均做好标记，拍照，若有表面结节，计数后，冻于液氮中。
裸鼠肿瘤接种[最新]
![裸鼠肿瘤接种[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/aa51d57cae1ffc4ffe4733687e21af45b307fed0.png)
裸鼠肿瘤接种一般有细胞接种和瘤块接种两种方式，接种取材有手术活检标本、癌性胸腹水标本和体外培养的细胞系三种。
做体外培养的细胞的裸鼠接种，一般用带6号针头的注射器取适量细胞悬液注射于裸鼠的皮下，部位看试验要求而定，一般在腋下或背部皮下，每个接种部位注射0.1-0.2ml。
就是将培养的细胞收集起来调整到适宜浓度重悬于不含血清的培养液或PBS中，放于冰盒中携至动物房，直接注射即可。
是牵涉到细胞株的成瘤性问题，可以通过增大细胞悬液浓度的办法来解决。
一般细胞浓度可在1×106到5×107之间，浓度再大就可能打不进去了。
具体浓度需要查相关文献。
如果成瘤率太低，可以通过把瘤块在裸鼠身上传2—3代的方法提高成瘤率，即将已成瘤鼠的瘤块取出接种于新鼠身上，成瘤后再取出接种新鼠，如此传几代，肿瘤性质稳定后，再将肿瘤取出，剪碎、研磨、匀浆成为细胞悬液后再接种。
一、可移植性肿瘤的建立方法1．腹水瘤的建立将动物实体瘤细胞注入受体动物腹腔内，或将实体疤移植于受体动物的腹壁内，肿瘤生长后引起腹水，腹水内含高大量瘤细胞可移植传代．即为腹水瘤。
建议腹水瘤初期、腹水往往是血性，多次传代后逐渐变为乳白色的瘤性腹水。
腹水如培养基一样供给瘤细胞生长所需的营养。
若将腹水瘤细胞注入皮下，又可形成实体瘤。
由于瘤细胞游离在腹水内，因此总呈圆形，体积可有大、中、小之分c：r．在一些细胞边缘偶见大小不等的泡状突起，称之为“鼓泡”。
一般在接种后第5天时核分裂相达高峰。
偶见三极或四极分裂。
二、肿癌移植方法1．常规保种传代方法(1)腹水瘤移植方法：瘤源一般用接种后第5～6天的腹水，抽出的腹水以乳白色为佳。
接种应从下腹部注入受体动物腹腔，一般接种0.1- 0.2m1。
可在腹水内加适量的抗凝药物。
(2)实体型肿瘤接种法：1)小块接种法：将瘤取出后，切开，选出生长良好而无变性坏死、呈谈红色、鱼肉状的瘤组织，切成小块(约5×5×5mm)；在受体动物腹部外例剪开—个小口，用无钩眼科镊子夹取小块，送入切口内皮下。
肿瘤侵袭转移技术ppt（划痕实验，transwell，裸鼠尾静脉）
肿瘤侵袭转移技术ppt（划痕实验，transwell，裸鼠尾静脉）展开全文取之于园，回馈于园。
先贴上ppt的图，一共有28张ppt，ppt里也有一些动图，需要讲相关课程可以下载ppt，不要叮当内容都是取自园子里前辈们的，图之后我会贴上当时我讲的逐字稿，欢迎大家指正错误，共同学习。
大家好，今天我和大家一起来看一下肿瘤的侵袭和转移相关实验技术我们将从这四方面来看首先是概述：实验探究细胞的侵袭转移可以分为体内和体外两个方面在体外实验现在我们常用的是细胞划痕实验和transwell，在体内实验我们可以使用的技术为裸鼠尾静脉注射以上为现在在国际上较为通用和认可的探究肿瘤侵袭和转移的技术首先是细胞划痕实验，细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力通俗的理解一下，就是用东西在一个铺满细胞的板子或培养基上用画一条线，线上的细胞被机械力去除掉了，通过一段时间的培养，我们可以观察细胞向无细胞区域迁移的情况，体现了细胞的一种迁移能力。
该实验优点：1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。
2.适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。
3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。
4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
我们所需的实验材料有以下：细胞样品仪器、耗材：6孔板 marker笔直尺枪头试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS首先，1.所有能灭菌的器械都要灭菌在超净工作台，就是这个，将所有器材紫外线消毒30min，需要消毒灭菌器材包括——离心管、吸管筒、移液枪、枪头、直尺、marker笔等在6孔板背面画线5-6条，这个就是6孔板，有的人也会用更多孔的板子，在板子的背面，我们用直尺和marker笔画出间距均匀平行的线，这个不行哈。
在每孔加入5X105个细胞，这里数量不同细胞可能不一，原则把握为1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整 2.数量少时可培养一段时间至铺满板底5.用1ml枪头垂直于孔板和画的线，制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致这里要注意：人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷，后面提到的一种新技术可以避免这一问题6.吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞7.加入无血清培养基，并根据需要设加实验组、对照组8.放入37度5%CO2培养箱，培养。
小鼠裸鼠肿瘤动物模型课件
小鼠裸鼠模型在体内肿瘤药理学研究中的 应用
药物代谢
研究小鼠裸鼠对药物的代谢 和转化，为药物治裸鼠对不同药物治 疗的反应和耐药性。
肿瘤生长及转移
研究小鼠裸鼠肿瘤生长和转 移机制，探索抑制肿瘤发展 的方法。
1 易于培养和繁殖
小鼠裸鼠繁殖速度快，能够满足大规模实验的需求。
2 易于操控
小鼠裸鼠对基因编辑和药物处理的反应性高，便于研究者进行实验操作。
3 相似的生理特征
小鼠裸鼠与人类有许多相似的生理特征，有助于预测药物疗效。
小鼠裸鼠模型的建立方法
1
移植裸鼠
将人体肿瘤细胞或肿瘤组织移植到小鼠裸鼠体内。
2
基因编辑技术
小鼠裸鼠肿瘤动物模型
肿瘤研究中的重要工具，通过建立小鼠裸鼠模型，我们可以深入了解肿瘤的 发展和治疗方法。
常用的实验动物模型
小鼠
被广泛用于基础生物学、药 物研发和疾病模型研究。
裸鼠
因其缺乏皮肤毛发而成为理 想的肿瘤研究动物。
其他动物
包括大鼠、猪、犬等，具有 特定的研究目的和应用场景。
小鼠裸鼠作为肿瘤模型的优点
小鼠裸鼠模型在肿瘤研究中的 局限性
小鼠裸鼠模型无法完全模拟人体内的复杂环境，其它动物模型和体外实验仍 然具有重要意义。
小鼠裸鼠模型未来的发展及前 景
未来，借助基因编辑和体外模型技术的发展，小鼠裸鼠模型将更加准确和可 靠，为肿瘤研究带来更多突破。
利用CRISPR-Cas9等方法改变小鼠裸鼠的基因表达，模拟人类肿瘤。
3
毛发缺失技术
通过遗传或激素处理使小鼠裸鼠丧失毛发，便于观察肿瘤生长。
小鼠裸鼠模型在体外药物筛选中的应用
裸鼠成瘤实验-超详细资料
裸鼠成瘤实验-超详细资料裸鼠成瘤实验总结-超详细资料接种量接种部位接种部位:腋窝中部外侧皮下为好。
皮下肿瘤模型中，想要成瘤率高就接种在腋下。
接种时由裸鼠体侧腰部稍靠上的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向头部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，退出针头，这样操作的目的并不完全是避免漏液，其实熟练后，不需要皮下穿行也不会漏液，主要是避免污染，进针点还有少量污染的可能性的，针头在皮下穿行一段后，接种点离进针点较远，最大限度减少污染的可能。
如果是用于正式实验，那么一只老鼠就只能接种一个位点，不可以接种多个位点用于保证可用的模型数。
因为在有些情况下，一个老鼠身上有多于一个肿瘤的情况下，会有相互影响的可能，无论这几个肿瘤相距有多远。
要是想多打几个部位做做预试验，倒也不是不可以，但是我觉得，基本上没有什么必要。
皮肤不用绷得太紧，平展就可以了，另外接种的时分进针点很靠下，针头在皮下走一段再注射，速度不要太快。
注射前针头稍微动一动，能动就申明在皮下，不然大概在皮内或者肌肉内。
普通来说都是有鼓包的但是要是你接种位置太深入腋窝，你是看不到鼓包的。
主要靠针头稍微动一动来判断。
是否应用免疫抑制剂裸鼠皮下种瘤后，可以通过应用免疫抑制剂，比如环磷酰胺（2mg每只，打两天）来加速瘤体的生长，当然我知道裸鼠是T免疫缺陷动物，但是人家说的CTX可以进一步抑制裸鼠的体液免疫和NK细胞杀伤的保护作用，可以加快瘤子的生长，这样造模的周期很短，也可以进行人为的控制，不知道这个观点是不是有道理，实践中是不是真有人这么做呢？楼上说的文献中也有报道，而且还有预先用放射照射抑制动物免疫功能再接种的方法，但是一般常规应用中大多数时候不推荐这么做。
另外还有一个问题应该被考虑到，大家现在都在琢磨着怎么让肿瘤出瘤的更快，造模周期更短，但是如果人为的把肿瘤生长加速，其实对实验并不好。
因为造模周期短，很可能生长速度也会被加快，肿瘤可能很快就溃烂了，这样就不得不被迫中止实验，而用药却没有用到足够的时间，药效还没有发挥出来就结束了，这样是很不利的。
肿瘤实验动物模型专家讲座
肿瘤实验动物模型专家讲座
第6页
胃癌动物模型
试验目标：经过化学诱导法（甲基胆蒽） 复制胃癌动物模型
试验动物 ：小鼠，体重20g左右 试验方法 ：胃腺粘膜穿挂含甲基胆蒽(MC)
线结，含MC线结是用普通细线，在一端打 结后，将线结置于盛有MC小玻璃试管内， 再在酒精灯上微微加温．使MC液化渗透线 结而成
肿瘤实验动物模型专家讲座
第10页
肝癌动物模型
试验目标 ：化学诱导法和人肝癌原位移植制作肝 癌动物模型
试验动物：Wistar大鼠
试验方法:用1.23μmol乙硫氨酸给大鼠灌胃。4小 时后即可见肝细胞内有脂肪从容，以后伴随时间 推移而加剧。在24～48小时到达高峰，此时肝内 脂肪含量约为正常20倍。本法引发肝脏病变主要 为脂肪变性，极少或没有肝细胞坏死。若以0.5％ 浓度连续喂养动物2个月，可引发胆管增殖及结节 性肝硬化；若连续给药8～9个月，有些动物可发 生肝癌
肿瘤实验动物模型专家讲座
第5页
试验参考结果
诱发肿瘤位于从咽部到胃贲门食管任何部 伙，肿块突出腔内引发食管阻塞
在诱发食管肿瘤中，乳头状瘤达100％；乳 头状癌67％；浸润型癌(无蒂)为63％，全部 肿瘤起源于鳞形上皮
诱发食管癌极少有远处转移，值得一提是 用MBZN诱发仅是食管癌而不发生其它脏器 肿瘤，可见MBZN对诱癌器官有专一性
受第4页
食管癌动物模型
试验目标 ：经过化学诱导法（亚硝胺）复 制食管癌动物模型
试验动物 ：Wistar大鼠，体重100g以上 试验方法 ：取试验用鼠，在试验期间任其
自由食用含甲基苄基亚硝胺(MBNA)饮水， 并将MBNA掺入饲料中，使试验动物每日摄 入量达0.75mg•kg-1。连续喂养100天，处 死动物，进行组织学检验。可获食管癌模 型
实验动物肿瘤模型的建立及应用概述PPT课件
主要程序:
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2
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8 9 (w)
2023/12/31
基础饲料 AFB1腹腔注射 0.015%的AAF饲料
移植性肿瘤的建立及应用
1、同种可移植性肿瘤 2、异种可移植性肿瘤
2023/12/31
腹水瘤的建立
2023/12/31
将移植性实体瘤细胞注入同种受体动 物腹腔内,移植于受体动物腹壁内或其
它部位,待肿瘤生长后引起腹水。
2023/12/31
诱发性肿瘤模型 的建立及应用
2023/12/31
诱发肿瘤的基本方法、途径
涂抹法 经口给药法 气管内直接注入法 穿线法 注射法
2023/12/31
黄曲霉毒素诱发肝癌模型
基础知识:黄曲霉毒素为强至癌物,动物经口 摄入便可诱发大量肝癌。 在本实验利用大鼠进行腹腔注射法。
2023/12/31
将带瘤腹水给同种同系动物移植传代, 即可形成腹水瘤。
2023/12/31
2023/12/31
2023/12/31
1、研究人的一生至少需要半个世 纪,而一些动物(鼠、兔、鸡)等至 多十年就够了。
2、利用病人组织活检和尸检的分 析很难得到肿瘤发展全过程的资 料,而通过动物则易获得。
3、凡不能在人体内进行的实验程 序和干扰计划均可经动物肿瘤模 型实现。
2023/12/31
诱发性肿瘤模型的建立及应用 可移植性肿瘤的建立及应用
实验动物肿瘤模型的建立及应用概述
2023/12/31
实验动物的研究在我国的发展
50年代中期 中国1号、津白1、 津白2等近交系小鼠
50-90年代 建立大量可移植性瘤 株,有近百余种人类癌细胞系被 建立
至今各省市科研单位已建立大量 裸鼠培育室,制定出医学实验动 物管理暂行条例
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瘤
2.建株的人体肿瘤组织培养细胞
理论上建株的肿瘤细胞均可以
我们实验室均采用细胞株作为材料，这个方式是 性价比最高的，操作简便，材料安全且容易获取。
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细胞株的选择 细胞的选择大致有一下几个方面：
1.国际公认度较高的细胞株。 2.根据体内生长情况来确定，很多细胞株，在文献中有
很高的出镜率，但是实际上，基本都是从体外开始有名。 当然，我们对于细胞株的选择是没有选择的！
一些比较有争议的细胞：
Hela（宫颈癌），HCT（人回盲肠癌细胞/人结直肠癌腺癌细胞）。
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细胞慢病毒感染
1、慢病毒保存
理论上慢病毒可在-80℃保存6个月，在4℃可保存3天。因为 慢病毒每次冻融会降低病毒滴度10%，因此慢病毒实验最好 是提前分装。
2、MOI值
细胞感染达到80%以上所需MOI值，这个大部分细胞是可以 查到，不过因为因为慢病毒感染细胞是很灵活的，因此MOI 值的选择也是很有差异性的，具体情况具体分析。
裸鼠皮下成瘤
---慢病毒感染后的细胞
1
裸鼠
无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）。目前已成为医学 生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。特别是在肿瘤学 、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等 实验方面，它有着特殊的价值。
裸鼠（纯合子nu/nu突变鼠）主要表现为无毛（但可看到一 种细毛组织学证明有被毛滤泡）以及缺乏正常胸腺。杂合子小 鼠（nn/+）各方面表现都正常。
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细胞慢病毒感染
附：慢病毒使用量的相关计算公式 MOI=（慢病毒使用的体积*慢病毒滴度）/ 需要感染的细胞数 其中：慢病毒使用体积单位为ml 慢病毒滴度单位为TU/ml 例如： Hep-G2细胞，MOI=20，慢病毒滴度=1.0*108 TU/ml, 24孔板的细胞总数：2.0*105个。 因此：感染24孔板中1孔的HEP-G2细胞所需要的慢病毒体积 为： (20* 2.0*105)/ 1.0*108 =0.04ml
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形态特征 裸小鼠(基因符号nu):
无毛(hair less),无胸腺(athymus).幼鼠(3－4周龄),成年鼠(6－8周龄。 抵抗力差，易在SPF环境下可生存，所用的笼具、垫料、饲料、 饮 水患病毒性肝炎和肺炎，因而饲养和繁殖要求条件比较严格，等都要 求经过严密灭菌消毒并采用隔离器饲养，以保证长期存活并进行繁殖。
小鼠中有若干突变基因，它可产生一种为无毛的表现型（ phenotype），例如无胸腺裸鼠（Nude）、裸鼠（Naked）、无 毛鼠（Hairless）、无鼻毛鼠（Rhinol），不要把这些突变鼠基 因相互混淆。裸鼠的唯一特性是胸腺缺陷表现型，因此，不能 将“裸鼠”与“无毛鼠”两词交换使用。
2
裸鼠
裸小鼠 裸大鼠
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裸鼠成瘤
附：我们实验一些裸鼠成瘤的成功案例Hep-Gຫໍສະໝຸດ 细胞A375细胞14
一些其他情况下的裸鼠成瘤 裸鼠皮下成瘤后，除了一些常规的检测外 我们一般可进行以下一些实验操作：
裸鼠活体荧光
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相关裸鼠皮下成瘤的建议 1、裸鼠的品系。 2、裸鼠成瘤用的材料：细胞的选择。 3、客户的具体要求：比如说肿瘤形成部位，是否需要详细
裸大鼠(基因符号rnu )：
一般特征似裸小鼠，但躯干部仍有稀少被毛并非象裸小鼠那样完全 无毛，头部及四肢毛更多。裸大鼠易患呼吸道疾病。
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裸鼠的选择
虽然说以裸大鼠代替裸小鼠，具有移植肿瘤大，取 血量多，可行某些外科小手术等优点。因此比裸小鼠有一 定优越性，其缺点是维持经费比裸SPF小鼠更高，另外裸 大鼠目前不怎么流行。所以我们实验室常用的是BALB/cnu裸小鼠。
7
常见的细胞株
常规较容易成瘤的细胞：
Hep-G2（肝癌，Hep2（喉癌），NCI-H460(大细胞肺)，A431(表皮 癌),SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌），A375/B16-F10（人黑 色素瘤细胞）。
可以成瘤但是比较慢的细胞：
CNE（鼻咽癌），A549（肺癌），SPC-A-1（肺腺癌）。HT-29 （结肠癌），EL-7402（肝癌）。
记录肿瘤的大小变化，是否需要取材后需要怎么拍摄裸鼠 的照片等等。
16
谢谢大家！
17
随着裸小鼠年龄增长或有关因素的影响(如病毒感 染),裸鼠体内正常T细胞会增加，故接种肿瘤实验一般采用 4--6周龄的裸鼠。
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裸鼠成瘤方式
1.人体原发癌
结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤
裸
、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织
鼠
肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百
成
分比（35.7%）的良好生长，并可传代。
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细胞慢病毒感染 附：一些细胞的慢病毒感染效果图 K562
A549
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裸鼠成瘤
细胞培养：
细胞的状态以及数量是裸鼠皮下成瘤很关键的一步。细胞 状态良好，对数生长期，接种很容易形成肿瘤，反之则会 导致失败。即浪费了细胞，又错过了裸鼠成瘤的最佳时期
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裸鼠成瘤
细胞接种：
接种的细胞量：无血清培养基重悬成1*107个/ml的悬液，0.2ml/只/ 针。也就是一只裸鼠最少要用200W个细胞，有的细胞需求可能会 达到1000W个/只。 接种的部位大部分颈部和腋下皮下。血丰富，能提供大量的营养。 当然，这个也是可以调整的。 另外裸鼠理论上是1个裸鼠只能接种1针，形成1个肿瘤。因为2个或 者以上的肿瘤是会相互影响的。