肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的临床前抗肿瘤作用研究
TRAIL及其受体促凋亡机制与消化道肿瘤治疗的前景
Ｙｉｇ， ｎ ＹＵＡＮ ｏｚ ｎ Ｙａ —ｏ ｇ．Ｄｅ ｒｍｅ ｔ ｆ Ｇａ ｔｏ ｎｅｏｏ ｐａ ｔ ｎ ｓｒｅ ｔｒ ｌｇｙ，ＲｕｊｎＨｏｐ ｔｌ ｈ ｎ ｈ ｉ ａ ｔｎ ｉｅ ｓｔ ｄ ｃ ｌＳ ｈ ｏ ， ｏ ｉｉ ｓ ｉａ ，Ｓ ａ ｇ ａ ｏｏ ｇ Ｕｎｖ ｒｉｙＭｅ ｉａ ｃ ｏ ｌ Ｊｉ
朱 颖 袁 耀宗
摘 要 ： 瘤 坏 死 因 子 相 关 凋 亡 诱 导 配 体 （ ＲＡＩ 因 其 选 择 性 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 的 特 点 而 受 到 关 注 。 肿 Ｔ Ｌ）
ＴＲ Ｌ促 肿瘤细胞 凋 亡的机制 及其 受体对 它的调 控机 制 尚在探 索 中。 目前 ， ＡＩ ＡＩ ＴＲ Ｌ及其 受体 已被 广泛 运 用于 消化 道肿 瘤的治 疗研 究中 ， 不同的 消化道 肿瘤细 胞株 对 ＴＲ Ｌ诱 导 的凋 亡敏 感性 不 同 ， 些细 胞株 对 ＡＩ 某 ＴＲ Ｉ耐 药。克服 肿瘤 细胞对 Ｔ ＡＩ ＲＡＩ 的耐 药 ， Ｌ 同时保护 正 常细胞 免受伤 害 ， 充分发挥 Ｔ ＡＩ Ｒ Ｌ选择性 杀 伤 肿瘤细胞 的优 点 ， 将使 ＴＲ Ｌ在 抗癌 方面发挥 积极 的作 用 。 ＡＩ
关 键 词 ： 瘤 坏 死 因子 相 关 凋 亡 诱 导 配 体 ； 亡 ； 肿 凋 胃肠 道 肿 瘤 治 疗
Ｔｈｅｍ ｅ ｈａ ｓ ｏ ｃ ｎｉｍ ｆＴＲＡＩ ａ Ｌ ｎｄ ＴＲＡＩ Ｒ ｎ ｃ ｄ ａ ｏ ｏ ｉ ｎ ｈ ｏ ｐｅ ｔｏｆｉｓｒ ｅ ｎ ｇ ｓｒ ｎｔｓｉ ａ ｕ ｏ ｈ ｒ ｐｙ Ｚ Ｈ Ｕ Ｌ— ｉ ｄｕ ｅ ｐ ｐｔ ｓｓａ ｄ ｔ ｅ ｐｒ ｓ ｃ ｔ ｏｌｓ ｏ ａ ｔ０ｉ ｅ ｔｎ ｌｔ ｍ ｒ ｔ ｅ ａ
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国际 消 化病 杂 志 ２ （ ０｝ ８年 ４月 第 ２ ８卷 第 ２期 ＩｔＪＤｇＤｓ ｎ ｉ ｉ，Ａｐｉ２ ２ ０ ，Ｖ １ ８¨ ． ｒ ５ ０ ８ ｏ．２ ， ｌ
t(17;19)-急性淋巴细胞白血病细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性及其意义
t(17;19)-急性淋巴细胞白血病细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的敏感性及其意义张晓春;郑晓敏;陈诚;李义德【摘要】目的:观察t (17; 19)-急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)所介导的细胞毒的敏感性及可能机制,并探讨其临床意义.方法:以t(17; 19)-ALL细胞株4株、1例t (17; 19)-ALL患者骨髓标本为实验组,其他ALL细胞株28株为对照组.流式细胞术测定细胞表面TRAIL受体表达;重组人可溶性TRAIL (rhsTRAIL)作用后,3H-thymidine法测定其对细胞增殖的影响;FITC标记的Annexin-V染色及流式细胞术检测细胞早期凋亡;免疫印迹法观察细胞凋亡通路变化(caspase-8、Bia、caspase-3和PARP的表达).结果:t(17; 19)-ALL细胞表面死亡受体4(DR4)表达水平明显高于其他各组细胞株(P＜0.05),死亡受体5 (DR5)表达水平高于MLL+-ALL细胞株(P＜0.05),诱骗受体1(DcR1)和诱骗受体2 (DcR2)均呈阴性表达;rhsTRAIL浓度为100 μg·L-1时,t (17; 19)-ALL细胞抑制率接近100％,显著高于其他各组细胞株(P＜0.05或P＜0.01),该抑制作用在加入TRAIL中和抗体RIK-2及caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk后被阻断;加入rhsTRAIL后,t(17; 19)-ALL细胞发生早期凋亡,其凋亡率明显高于对照组细胞株(P ＜0.05); rhsTRAIL作用2h内,caspase-8、Bid、caspase-3和PARP出现活化条带.结论:t (17; 19)-ALL细胞株对TRAIL高度敏感,并最终对移植物抗白血病(GVL)效应敏感,t (17; 19)-ALL患者为获得长期存活,应及早进行同种造血干细胞移植(allo-SCT).【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(040)001【总页数】6页(P164-169)【关键词】t (17;19)-急性淋巴细胞白血病;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;移植物抗白血病;细胞凋亡【作者】张晓春;郑晓敏;陈诚;李义德【作者单位】宁夏医科大学总医院儿科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院儿科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院儿科,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院医学实验中心,宁夏银川750004【正文语种】中文【中图分类】R733.71同种造血干细胞移植（allogeneic stem cell transplantation，allo-SCT）后，移植物抗白血病效应（graft versus ceukemia，GVL）由细胞毒性T细胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）和自然杀伤（natural killer，NK）细胞所介导[1]，是白血病患者得以治愈的关键反应。
TRAIL联合IFN-γ诱导骨肉瘤细胞凋亡实验研究
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１ ４ ９ ・
国际 骨 科 学 杂 志
２０ ０ ８年 ５月 第 ２ ９卷
第 ３期
Ｉ ｔ ｔ ｏ ， ｙ ２ ，２ ０ ， １ ９ Ｎｏ ３ ｎ Ｏｒ ｐ Ｍａ ５ ０ ８ Ｖｏ．２ ， ． Ｊ ｈ
Ｔ ＡＩ Ｒ Ｌ联合 ＩＮ ７诱导骨 肉瘤 细胞凋亡实验研究 Ｆ －
００ ）联 合 用 药 组细 胞 凋 亡 率 显 著 增 加 （ ＜ Ｏ ０ ）应 用 ＩＮ ７前 后 ， Ａ Ｉ死 亡 受 体 （ Ｒ） ．１； Ｐ ．１； Ｆ－ ＴＲ Ｉ Ｄ ４的 相 对 表
达量 增 加 ， Ｎ－ Ｉ ７作用 ２ 小 时表 达 量 最 大 ， Ｆ ４ 两者 有 显 著 性 差 异 （ ＜ （ ０ ） 联 合 用 药 组 对 成 纤 维 细 胞 的 毒 尸 ） １； ．
Ｚ ＨＡＯ ｎ Ｘｉｇ，Ｆ ＡＮ ｈ ｎⅫ ．Ｄｅ ａ ｔ ｎ ｆ Ｏ ｔｏ ａｄ ｃ ｉ ｎＲｕ ｈ ｗ ｓ ｉ ｌ ｏｌｇ ｆＭｅ ｉｉｅ Ｓ ｕ一 ｐ ｒｍｅｔ ｒｈ ｐ ｅ ｉ ，Ｓｒ ｏ ： Ｒｕ ｎＳ ａ Ｈｏｐ ｔ ，Ｃ ｌ ｅ ｄ ｃｎ ， ａ ｅ ｏ
Ｚｈｊａ ｇ Ｕ ｉｅｓｔ ＳｒＲｕ ｎ Ｓ ａ Ｉｓｉ ｔ ｆ ｌｎｃ ｌＭｅ ｉｉｅ， Ｚ ｅｉｎ ｎｖ ｒｔ ｅｉｎ ｎｖｒｉ ｌ ｙ； ｉ ｎ Ｒｕ ｈ ｗ ｎｔ ｕｅ ｏ Ｃ ｉｉ ｄｃｎ ｔ ａ ｈｊａ ｇ Ｕ ｉｅｓｉ Ｈａ ｇ ｈ ｕ ｙ， ｎ ｚ ｏ
Ｅ ｐ ｒ ｍｅ ｔ ｌｓ ｕ ｙ Ｏｌ ａ ｏ ｔ ｓｓｏ ｓｅ ｓ ｒ ｏ ｅ ｌｉ ｄ ｃ ｄ ｂ ｘ ｅ ｉ ｎ ａ ｔ ｄ ｌ ｐ ｐ ｏ ｉ ｆ ｏ ｔｏ ａ ｃ ｍａ ｃ ｌ ｎ ｕ ｅ ｙ ＴＲＡＩ ｃ ｍｂ ｎ ｄ 、ｉｈ Ｉ Ｎ． Ｌ ｏ ｉ ｅ ｖｔ Ｆ Ｙ
抗TRAIL死亡受体抗体及其在肿瘤治疗中的研究进展
［ ｙｗｏ ｄ］ Ｃａ ｃ ｒ ＴＲＡＩ ＤＲ４ ＤＲ５ Ａｎ ｉ ＴＲＡＩ ｅ ｔ ｅ ｅ ｔｒａ ｔｂ ｄｅ Ｋｅ ｒ ｓ ｎｅ Ｌ ｔ— Ｌ ｄ ａ ｈ ｒｃ ｐｏ ｎ ｉｏ ｉｓ １ 前 育
Ｔ ＡＩ Ｒ Ｌ在 人 体 许 多 正 常 组 织 中 都 可 检 测 到 ， 括 脾 ， ， 列 包 肺 前
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胞， 并在 癌症 治 疗 上 显 示 了 良好 的 治 疗 效 果 。本 文 就 Ｔ ＡＩ Ｒ Ｌ的 凋 亡 诱 导 途 径 以 及 抗 Ｔ ＡＩ Ｒ Ｌ受 体 抗 体 在 肿 瘤 治 疗 中 的研 究进 展 作 一 综 述 。 【 键 词 】 癌 Ｔ Ｉ ＤＲ ＤＲ 抗 Ｔ ＡＩ 关 ＲＡ Ｌ ４ ５ Ｒ Ｌ死 亡 受 体 抗 体
NK细胞的生物学及在肿瘤治疗中的作用
综述NK细胞的生物学及在肿瘤治疗中的作用自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）是一种骨髓衍化的淋巴细胞，由于在形态上胞浆丰富，胞质内含有大型嗜天青颗粒，故又称为大颗粒淋巴细胞（large granular lymphocyte，LGL）[1,2]。
1971年Cudkowizc 和Bennett首次描述了这类细胞的功能，他们发现经放射线照射的小鼠接受母体来源的骨髓细胞移植后发生了排斥反应[3,4]。
传统理论认为，移植抗原是共显性遗传的，例如，亲代抗原在第一代杂种共表达，子代能够耐受亲代的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）[3]。
然而，Cudkowizc 和Bennett发现H-2基因杂合体的第一代杂种鼠经放射线照射后能够排斥亲代H-2基因纯合体小鼠的骨髓细胞。
这种现象被称为“杂交抵抗”。
后来发现介导这种现象的细胞是一种淋巴样细胞，对放射线不敏感，能在体外直接杀伤肿瘤细胞，且无MHC限制性[1,5-7]。
随后就将这类细胞命名为NK细胞。
与T、B细胞免疫激活过程不同，NK细胞的免疫反应是迅速的，意味着其可在感染最初阶段清除病原体。
事实上，众多研究已表明，NK细胞可以清除胞内菌和寄生虫感染，在控制一些病毒感染的过程中也起重要作用[8-11]。
尽管一些体内外试验表明，NK细胞具有抗肿瘤活性，但是其确切机制还不完全清楚[12-14]。
1. NK细胞的生物学特征NK细胞占外周血淋巴细胞的10-15％，也存在于脾脏、骨髓及其它组织，包括肝脏、腹腔、胎盘[1]。
NK细胞在肿瘤和病毒感染中发挥很重要的免疫监视作用，构成机体免疫系统第一道防线。
与免疫系统其它细胞（尤其是T细胞）不同，NK细胞不能被抗原重复刺激致敏而且没有长期的抗原记忆功能。
NK细胞缺乏特异性的细胞表面分子标志，许多标志认为是NK相对特异性的，比如小鼠NK细胞表面的NK1.1、DX-5、ASGM1，人类NK细胞表面的CD56，CD16[1,15-18]。
索拉菲尼联合TRAIL对诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响
索拉菲尼联合TRAIL对诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响王德华;刘云燕;李敏然;苗同国;孙杏丽;任桂芳【摘要】目的观察索拉菲尼(SOR)联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对肝癌细胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影响.方法培养人肝癌细胞株SMMC-7721,进行同步化,分为对照组(无血清培养基)、SOR不同浓度干预组、TRAIL不同浓度干预组及SOR联合TRAIL组,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制率及流式细胞仪作凋亡分析,Western blot法检测Mcl-1蛋白表达.结果 MTT法结果显示不同浓度SOR或TRAIL单药处理组,其细胞生长抑制率随着浓度的增加而逐渐增强,而SOR(2μmol/L)联合TRAIL组,其抑制率均高于TRAIL不同浓度干预组(P<0.05).3组药物干预组细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01),SOR干预组(2μmol/L)的细胞凋亡率与TRAIL干预组(100 ng/ml)比较差异无显著性(P>0.05),而SOR联合TRAIL组(2μmol/L+100 ng/ml)的细胞凋亡率显著高于其他2组(P<0.05).SOR联合TRAIL可明显抑制SMMC-7721细胞内Mcl-1的表达(P<0.05).结论SOR联合TRAIL能够抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,增强其凋亡,其机制可能为通过Mcl-1发挥了协同作用.【期刊名称】《解放军医药杂志》【年(卷),期】2018(030)008【总页数】4页(P21-24)【关键词】肝肿瘤;索拉菲尼;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;凋亡【作者】王德华;刘云燕;李敏然;苗同国;孙杏丽;任桂芳【作者单位】石家庄市第五医院肿瘤科;石家庄市第五医院感染四科;石家庄市第五医院感染四科;石家庄市第五医院肿瘤科;石家庄市第五医院感染四科;石家庄市第五医院感染四科【正文语种】中文【中图分类】R735.7原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，易发生侵袭转移，预后差。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其在妇科肿瘤中的研究进展
并命 名 为 Ａ ｏ ２ 。Ｔ Ｉ 因定位 于 人类 第 三 号 ｐ － Ｌ Ｒ Ｌ基 Ａ
染色 体 长 臂 二 区 六 带 （ ｑ ６ ，编 码 ２ １个 氨 基 ３２ ） ８ 酸 ，相 对 分 子 质 量 是 ３ ２ ×１ ． ５ ０ ，等 电点 为 ７ ６ ， ． ３
细胞 凋 亡 （ｐｐｏｉ）是 由美 国病理 学 家 Ｋ ｒ ａｏｔｓ ｓ ｅｒ 等 于 １７ ９ ２年首 先描 述 ，取 自希腊 文花 瓣脱 落之 意 ，
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体
近年来许多研究显示,除了诱骗受体对 细胞的保护作用外,TRAIL还能通过激 活Akt途径核因子κB(NFκB)、蛋白激酶 C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)家族成员等多种机制调节 TRAIL的凋亡诱导活性。此外,死亡受 体核苷酸的突变和OPG的竞争性作用 也可能造成细胞对TRAIL的抗性。
此外，死亡受体与配体结合后，促使磷脂酶 C水解卵磷脂生成甘油二脂，甘油二脂使蛋 白激酶C-Б活化，蛋白激酶C-Б能够使磷脂 爬行酶-3（Phospholipid scramblases 3 PLS 3 ）磷酸化，之后促进线粒体膜上磷脂 的双向运动，与Bid相互作用，导致细胞色 素C的释放，促使procaspase-9自身催化形 成有活性的caspase-9,进而活化效应蛋 caspase-3,最终导致细胞凋亡。
2. 2 正常细胞或肿瘤细胞抗TRAIL 诱导凋亡的机制
TRAIL最大的优点是它可以选择性诱导 肿瘤细胞凋亡,但对正常细胞没有毒副 作用。虽然DR4和DR5在肿瘤细胞和 正常细胞中的表达水平相当,但两种细 胞对TRAIL的敏感性确相差甚远,这就 不能合理解释正常细胞存在TRAIL抗性 的原因,直至人们发现了TRAIL的诱骗 受体才解释了其中部分原因。
2.1.1 半胱天冬酶(caspase)和死亡 受体相关的细胞凋亡途径
TRAIL三聚体能诱发死亡受体DR4和DR5三 聚体化。死亡受体一端通过胞外区的半胱氨 酸富集区与TRAIL结合并被活化,另一端通过 胞内区的死亡结构域与接头蛋白(adaptor pro-tein)C端的死亡结构域结合,接头蛋白再 以其N端死亡效应域(DED)与半胱天冬蛋白 酶原(pro-caspase)在末端的局部募集并串连 结合,形成TRAIL-死亡受体-接头蛋白-procaspase死亡诱导信号复合物(DISC)，
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的临床前抗肿瘤作用
研究
1.pHS-TRAIL表达质粒的构建人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(human TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand, hTRAIL)是一种跨膜蛋白,由281个氨基酸组成,其中1-14位氨基酸为胞内区,15-40位氨基酸为跨膜区,41-281位氨基酸为胞外区。
由于114-281位氨基酸的胞外区片段完全具有促细胞凋亡活性,同时完整的rhTRAIL蛋白分子在体外较难获得表达,因此我们选择114-281位氨基酸所在肽段进行重组表达质粒的构建。
先前的研究发现,rhTRAIL表达系统的选择具有一定的难度,若使用真核系统对rhTRAIL蛋白进行表达,容易形成没有生物学活性的二聚体形式；当采用常规的原核系统例如T7表达体系和温度诱导性表达体系时,rhTRAIL蛋白又容易形成包涵体,这些表达系统的问题会给后期纯化工艺、产品质量等均会带来问题,因而我们选用了pBR322载体,并以此为基础构建了一个色氨酸启动子驱动目的基因的载体,随后在色氨酸启动子的下游插入编码hTRAIL114-281片段的基因序列,再将该重组质粒导入宿主菌W3110。
构建获得表达载体,确认目的蛋白的正确表达,并初步摸索了其在摇瓶水平影响表达的条件。
2. rhTRAIL的发酵及纯化工艺研究上一章节的研究中,通过基因工程技术将人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Recombinant Human TNF-related apoptosis-inducing ligand、rhTRAIL)编码胞外部分114-281aa的基因片段插入到表达载体pHS色氨酸启动子的下游,得到重组质粒pHS-TRAIL,而后将此质粒转化到W3110菌株内,基因测序结果显示插入的目的基因序列正确。
由于rhTRAIL 的临床使用剂量可能较大(通常百毫克级),因此对于表达系统、高密度发酵工艺
以蛋白纯化工艺的选择和优化以及质量控制均提出了较高的要求。
通常,影响大肠杆菌高密度发酵的因素主要包括细胞新陈代谢所需的营养的供给和控制、毒副产物(乳酸和氨)的控制或排出、氧气的供给以及关键参数,如pH值、溶氧浓度和温度等的实时控制问题。
本章就rhTRAIL的摇瓶培养、发酵生产工艺以及纯化工艺进行了初步的研究和优化,通过对培养基的组成、高密度发酵条件的优化以及纯化工艺的摸索,从而研究如何在保证生物制品产品质量的前提下提高目的蛋白表达量和纯化工艺的收率,并最终提高rhTRAIL的产量。
3. rhTRAIL的体外及体内药效学及机理研究在前面的研究中,我们通过对培养基的组成、高密度发酵条件的优化以及纯化工艺的摸索,在保证rhTRAIL蛋白品质的前提下提高了蛋白产量,获得了足够量的rhTRAIL蛋白纯品。
本章节我们进一步对获得的重组蛋白进行体外及体内药效学及机理研究。
由于重组TRAIL蛋白具有广谱抗肿瘤活性,因此我们将HCT-116、Colo-205、A549及MCF-7等12种肿瘤细胞作为体外药效活性研究对象,并且构建了人结肠癌HCT-116和Colo-205裸小鼠模型和非小细胞肺癌95D裸小鼠模型,采用单独用药、联合用药的方式进行了体内药效学研究；最后以A549细胞为实验对象,通过Annexin-PI双染和Western blot的实验手段研究了rhTRAIL蛋白的诱导细胞凋亡途径。
4. rhTRAIL在大鼠体内的药动学和组织分布研究在前述章节中,我们已经利用基因工程手段获得了具有生物学活性的rhTRAIL纯品；本章中,我们研究了大鼠静脉注射5、10和30mg/kg rhTRAIL后,血浆浓度经时变化曲线,并研究了大鼠静脉注射10mg/kg rhTRAIL后,各组织中的rhTRAIL分布情况。
结果显示在5-30mg/kg范围内,主要药物动力学参数AUC及Cmax与剂量呈线性相关,CL和V1在三个剂量组没有显著性差异(P>0.05),雌雄大鼠间各动力
学参数没有显著性差异,同时,大鼠静脉注射rhTRAIL后,其迅速分布到各组织。
肾脏为最主要的分布器官,其次为脾、血、卵巢、肝脏和肺,心、脑、脂肪、胃、肌肉、肠、胸腺和睾丸组织分布较低。
上述组织中rhTRAIL含量随着时间的延长迅速下降,未观察到蓄积现象。
结论肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)属于肿瘤坏死因子家族,在体内以三聚体的形式可与不同受体结合后通过不同信号通路介导细胞凋亡。
相关研究证实TRAIL蛋白对多种人肿瘤细胞(如肺癌、肝癌、结肠癌、白血病细胞等)具有生长抑制和细胞毒效应。
国内外一些制药企业均对TRAIL开展了多项临床前和临床研究,但进入临床后的研究进展则较为缓慢,对其原因也未见明确报道。
本研究在构建了重组TRAIL蛋白的表达体系并通过工艺优化获得了高纯度的重组TRAIL蛋白后,对其体外、体内药效以及体内代谢、组织分布性质开展了相关研究。
研究结果显示重组TRAIL蛋白在体内体外对不同肿瘤细胞均具有一定的生长抑制作用,体内代谢组织分布结果显示其在体内主要分布于肾脏。
上述结果一方面提示重组TRAIL蛋白具有良好的成药性,另一方面可能由于TRAIL蛋白被肾小球快速滤过所致的半衰期较短,提示联合小分子用药或TRAIL 蛋白偶联小分子药物可能更适合于该分子作为治疗性蛋白药物的开发方向。