酵母人工染色体
人造染色体载体是什么？
人造染色体载体是什么？对一些大型染色体组的序列分析往往需要克隆具有数十万甚至上百万个碱基对的DNA片段，为了满足克隆大片段外源基因的需要，科研工作者构建了人造染色体载体，如酵母人工染色体克隆载体、细菌人工染色体克隆载体等。
酵母人工染色载体(YAC)是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90min。
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒(TEL)。
YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因。
细菌人工染色体载体(BAC)是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶。
BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。
新型的BAC载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的Not工酶切位点和用于克隆DNA测序的Sp6启动子、T7启动子。
Not Ⅰ识别序列，位点十分稀少。
重组子通过Not Ⅰ消化后，可以得到完整的插入片段。
Sp6、T7是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。
P1人工染色体载体(PAC)结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。
然而除了将连接产物包装进λ噬菌体颗粒以及在cre—loxP位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组PAC也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持。
基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在60～150kb之间。
酵母人工染色体载体
YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序 列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN） 和两个端粒（TEL）。这些元件能满足自主复制、染 色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
7.HIS3EL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基 因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒 就是YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι 切开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段 DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转 化到酵母细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到 子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA 的转载导致抑制基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成 红色菌落，而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的 菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝 粒正常功能的所有顺式调控信息， 可保证YAC在酵母细胞分裂时向两 极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重 组，且能够稳定地复制；
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称 为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色 体的大小媲美。
如酵母人工染色体载体，它将酵母菌染色体上的复制区、 分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当 大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人 造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制 并遗传。
特殊酵母底盘细胞的染色体工程
特殊酵母底盘细胞的染色体工程染色体工程是一种利用基因工程技术改造细胞染色体的方法，通过对染色体的结构和功能进行调控和改变，可以实现对生物体的基因表达进行精确控制和调整。
特殊酵母底盘细胞的染色体工程是指对酵母细胞进行染色体改造，以实现特定功能或产生特殊产物的技术。
酵母是一类广泛存在于自然界中的真核微生物，常用的酵母包括酿酒酵母和面包酵母等。
酵母细胞具有许多优势，如易于培养、短生命周期、可扩大培养规模等，因此被广泛应用于生物学研究和工业生产中。
通过对酵母细胞的染色体进行工程改造，可以进一步提高其应用的灵活性和效率。
在特殊酵母底盘细胞的染色体工程中，主要包括以下几个方面的研究内容。
首先是染色体重构。
染色体重构是指通过改变染色体的结构和排列方式，实现对基因组的重新组合和调整。
通过染色体重构，可以实现对染色体上基因的定向插入、删除或替换，从而实现对基因组的精确编辑和改造。
染色体重构技术的发展，为酵母底盘细胞的染色体工程提供了重要的基础和手段。
其次是染色体组装。
染色体组装是指将基因组中的DNA片段按照特定顺序组装成完整的染色体。
通过染色体组装技术，可以实现对染色体的人工合成和设计。
在酵母底盘细胞的染色体工程中，染色体组装技术可以用于构建特定功能的染色体，如合成含有特定基因组的染色体，或者构建带有人工合成DNA片段的染色体。
还可以利用染色体工程技术实现染色体的重复和扩增。
通过在酵母底盘细胞中引入多个染色体副本，可以增加特定基因的拷贝数目，从而提高目标产物的产量。
染色体的重复和扩增技术可以通过改变细胞的遗传背景和环境条件来实现，从而达到增加产物产量的目的。
染色体工程还可以用于酵母底盘细胞的基因组定位和定向修饰。
通过在染色体上引入特定的DNA序列标记或标签，可以实现对基因组的定位和跟踪。
特殊酵母底盘细胞的染色体工程在生物学研究和工业应用中具有重要的意义。
通过对酵母底盘细胞的染色体进行工程改造，可以实现对基因组的精确控制和调整，从而提高酵母细胞的应用效率和产物的产量。
第4章人工染色体载体
西南大学生物技术专业 基因工程
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二、粘粒载体的工作原理
粘粒载体的主要工作原理类似l噬菌体 载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体 相当于l噬菌体载体的左右臂， cos位点通过 粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联 体。当多联体与l噬菌体包装的蛋白质混合时 l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两 个cos位点，并将两个同方cos位点之间的片 段包装到l噬菌体颗粒中去。
第四章 人工染色体载体
第一节 第二节 第三节 第四节
粘粒载体 酵母人工染色体载体 细菌人工染色体载体 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
本课件是在网络资源基西础南大上学改生物进技而术成专业，基在因此工程对有关人士特致感谢！ 1
常规载体在工作时都是在不影响质粒或 噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的， 同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一 来，这些载体所装载的容量就受到限制。利 用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段的载 体称为人工染色体载体，其装载外源DNA片段 的容量可以与 多个外源片段串联进入载体中 原料DNA片段短于200kb时，制备的目的DNA中相当一部分
的末端的一端不带酶切位点
总DNA纯度影响目的DNA的制备 西南大学生物技术专业 基因工程
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第节 细菌人工染色体载体
细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大肠杆菌的F 质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
F质粒：是一个约100kb的质粒，编码60多种参 与复制、分配和结合过程的蛋白质。
西南大学生物技术专业 基因工程
片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，从而使重组菌形成
红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落 为白色。
酵母人工染色体载体
工作原理：
用BamH Ι酶切去除载体上的HIS3顺序，再用EcoR Ι切 开克隆位点，形成YAC的左右两臂，与外源大片段DNA在 该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母 细胞后可像染色体一样复制，并随细胞分裂到子细胞中去， 达到克隆大片段DNA的目的。外源DNA的转载导致抑制 基因SUP4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落，而载体 自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。
酵母人工染色体pYAC4上的基本功能单位有：
1.CEN4顺序，来源于酵母第4号染色 体的着丝粒顺序，它提供酵母着丝粒 正常功能的所有顺式调控信息，可保 证YAC在酵母细胞分裂时向两极运动；
2.TEL顺序，来源于四膜虫大核中的 rDNA分子的末端，提供端粒形成顺 序，可保证YAC末端不被降解和重组， 且能够稳定地复制；
7.HIS3顺序。
酵母人工染色体载体的构建：
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA的复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)，以及必要的选择标记(TRP1等)基因 序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，获得的重组质粒就是 YAC载体。
常用的YAC载体有3种，即pYAC3、pYAC4和pYAC5， 其差别主要是sup4基因上的克隆位点不同，分别为SnaBI、 EcoRI和NotI位点。
优缺点
概念
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome,YAC) 是利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，是最早 构建成功的人工染色体载体，其工作环境也是在酿酒酵 母中。
酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长代时为90min， 含16条染色体，其大小为225~1900kb，总计有14×106bp。
1.YAC载体在酵母中复制的必需元件包括：
酵母人工染色体名词解释
酵母人工染色体名词解释酵母人工染色体是不同于野生型酿酒酵母的一种自组装的染色体，它包含了多个拟合于自身的人工功能模块。
该技术是一种基因工程的手段，它可以在细胞中稳定地表达外源基因，因此被广泛用于大量生产特定蛋白质等的生物工艺。
酵母人工染色体不仅可以用于蛋白生产，还可以用于碾磨药品的筛选、生物传感器等。
酵母人工染色体的名称中包括许多专业术语，下面我们来具体解释一下它的相关名词。
1. YAC(酵母人工染色体)YAC全称酵母人工染色体，是通过重组技术在自然含有酿酒酵母基因的端粒进行构建的。
在YAC中，长段DNA 可以被合成，然后以任意组合方式安置在酵母人工染色体上，这使得YAC成为了一个在酿酒酵母中稳定存在的人工染色体。
2. BAC（大肠杆菌人工染色体）BAC全称大肠杆菌人工染色体，一类完整的人工DNA 载体，可用于将大约300kb的DNA片段插入到大肠杆菌中。
其主要应用是研究基因的调控及表达模式，并用于生物工艺学、纯化重组蛋白以及创建高密度点图(系)等领域。
3. P1人工染色体P1人工染色体是另一种人工染色体，通常被设计成具有特定检测基因或特定功能的细胞向其直接植入特定基因。
它们也可以被用作高效的向线性染色体上整合基因的系统，作为染色体极配合体体内重组验系统，可用于测定基因，以及其他展示DNA片段的多米戈螺旋(曲线)系统。
4. 人工染色体人工染色体是指由人工合成的DNA序列组成的染色体，其中包括人工元件、核心染色体区域以及端粒等，满足构建染色体的基本要求。
目前，人工染色体经常用于从植物或动物细胞中扩增大长的DNA组件，再将其转移到另一个预先准备好的动植物中，从而扩展细胞学研究和治疗学应用领域的范围。
总的来说，酵母人工染色体是一种理解基因在不同层次上作用的途径。
它为我们提供了一个构建高度复杂的基因组的框架，对于我们理解基因的调控、维持、功能和遗传机理有着重要的意义，在医学、农业生产、食品工业等方面都具有重要的应用潜力。
人工染色体载体
自由之风L
定义
• 人工染色体(artificial chromosome)指人工构 建的含有天然染色体基本 功能单位的载体系统 • 天然染色体的基本功能单 位：复制起始点着丝粒和 端粒
定义
• 实际上是一种“穿梭”克 隆载体：含有质粒克隆载 体所必备的第一受体（大 肠杆菌）源质粒复制起始 位点（ori），还含有第二 受体（如酵母菌）染色体 DNA着丝点、端粒和复制 起始位点的序列，以及合 适的选择标记基因。
不足
• YAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的 基因工程 • 有些克隆不稳定 • YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离
哺乳动物人工染色体
• 哺乳动物人工染色体指从 哺乳动物细胞中分离出复 制起始区、端粒以及着丝 粒构建而成的克隆载体。 • 可以克隆大于1000kb的 外源DNA片段
优势
• • • • 有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析 研究哺乳动物细胞中染色体功能 对复杂的基因做功能分析 用于体细胞基因治疗
基因治疗
• 基因治疗（gene therapy）是指将外源正 常基因导入靶细胞，以纠 正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治 疗目的
方式主要有两种：1、修正和置换 2、增强和失活
MAC应用于基因治疗的优缺点
• MAC可以在宿主细胞中自主复制，不会插入患者基因组而 引起插入突变 • 容量大，可同时导入多个基因从而修正患者本身的缺陷 • 基因在人体中表达效率不高，人类的着丝粒和复制起始点 复杂且分离困难
人类人工染色体
• 人类人工染色体是一种小 型染色体，可作为载体搭 载一些基因，并作为人类 细胞中额外的染色体（第 47个），使这些基因表现 于人类体内。此种人工染 色体可载有约600到1000 万的碱基对。
酵母人工染色体的构建程序
酵母人工染色体的构建程序酵母人工染色体的构建程序染色体是生物体内的重要基因载体，包含了细胞遗传信息。
酵母人工染色体（YEAC）是通过人工手段构建的酵母基因组片段，具有重要的生物学和应用价值。
构建YEAC的程序是一个复杂而精密的过程，需要一系列步骤的有序进行。
首先，构建YEAC的第一步是设计合成目标染色体序列。
科研人员根据特定的研究目的和需求，选择需要构建的酵母人工染色体片段并进行基因序列的设计。
在设计过程中，要考虑到染色体稳定性、重要基因的完整性、引导序列的合理性等因素。
接下来，进行合成目标染色体序列的基因片段。
合成染色体片段的方法有多种，包括PCR扩增、化学合成、酶切连接等。
科研人员根据设计的基因序列，选择相应的合成方法进行基因片段合成。
在此过程中，需要考虑到合成效率、准确度以及避免合成错误的可能性。
完成基因片段的合成后，接下来进行染色体片段的组装。
这个过程需要将不同的基因片段按照设计顺序进行连接，并通过特定的酶切位点进行连接。
科研人员需根据设计的顺序和连接方式，进行准确而有效的组装操作。
构建YEAC的下一步是将组装好的染色体片段导入到酵母细胞中。
这个过程需要利用化学变性剂或电穿孔等方法，将染色体片段导入到酵母细胞中。
科研人员需要选择合适的导入方式，并进行适当的操作条件控制。
导入染色体片段后，需要进行筛选和鉴定工作。
这个过程是为了筛选出携带目标染色体片段的酵母细胞，并通过PCR扩增、序列测定等方法，进行目标染色体片段的确认。
科研人员需要仔细进行筛选和鉴定，确保所构建的YEAC是正确和稳定的。
最后，进行YEAC的研究和应用。
构建好的YEAC可以应用于基因组调控、基因功能研究、新药筛选等方面。
科研人员可以根据研究目的，设计相应的实验和应用方案，进一步探索和利用YEAC的潜力。
总之，酵母人工染色体的构建是一个复杂而精密的过程，需要经过设计、合成、组装、导入、筛选和鉴定等步骤，才能成功构建出目标染色体片段。
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细胞工程酵母人工染色体
一、酵母人工染色体（YAC）的基本元件
酵母染色体DNA自主复制序列（ARS）
酵母染色体的着丝粒序列（CEN）
酵母染色体的端粒序列（TEL）
选择标记：用于重组克隆的筛选
如：pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒，含有Amp大肠杆菌筛选标记。
二、YAC克隆系统的特点
YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200～500kb，甚至1000kb）。
用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC 变成一个大的YAC。
酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境。
三、YAC的构建
酵母人工染色体的构建程序
完整的染色体DNA的提取
基因组DNA酶切大片段的获取
✓用于脉冲电泳（PFGE）的高分子量标记的制备
✓目的DNA的酶切最适条件（控制内切酶量实现）
✓最适DNA大片段回收
YAC载体臂的制备
YAC臂与目的DNA大片段的连接
YAC重组体对酵母的转化
YAC基因库的保存
YAC基因库的鉴定
随机挑取100个YAC转化子，制备完整DNA，脉冲电泳分离，Southern转移，标记探针，预杂交。
目的基因YAC克隆的筛选
PCR法对YAC克隆进行筛选，菌落原位杂交作为辅助手段进行筛选
目的基因YAC克隆的鉴定
用目的基因的序列、pBR322和PCR产物微探针进行杂交鉴定
四、YAC的主要用途
◆YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。
◆用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和
DNA测序中发挥着重要作用。
◆在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都可采用YAC
克隆系统。
五、YAC的缺点
◆插入片段大，稳定性较差，不易操作；
◆插入的大片段常发生缺失，使文库不完整；
◆YAC与酵母天然染色体分子结构相似，分离时难与天然染色体
分开；
◆文库中的嵌合现象严重；
◆因插入片段大，往往发生序列重排，造成序列错乱。
思考题
1. 酵母人工染色体有什么作用？
2. 酵母人工染色体的构建程序是什么？
3. 酵母人工染色体有什么优缺点？。