氮代谢关键酶活性测定方法
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
硝酸还原酶的测定
硝酸还原酶的测定一、实验目的和要求掌握体内法测定植物组织中硝酸还原酶的原理和方法，阐明诱导酶的含义。
2、实验内容与原则硝酸还原酶（nr）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。
它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：--产生的NO2可以从组织渗透到外部溶液中，并在溶液中累积。
NO2含量的增加表明酶的活性增加。
装no2含量的测定用磺胺比色法。
在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对c氨基苯磺酸（或对c氨基苯磺酰-订线（胺）反应生成重氮，然后与αC萘胺（或萘基乙二胺）反应生成紫红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm波长处有最大吸收峰，可通过分光光度法测定。
溶液中NO2-的含量可用标准曲线测定。
3、主要仪器设备1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。
2、实验试剂0.1mol/lph7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液3.两组大麦幼苗在15-25℃的蒸馏水中培养一周。
一组用硝酸钾治疗，另一组用氯化铵治疗。
四、操作方法和实验步骤1.切两组新鲜叶片。
一组为0.51g处理苗，另一组为0.50g对照苗。
将叶片分别切成0.5~1cm的碎片并压实。
2、两组中各加入15ml的酶促反应液。
3.真空提取10min，充分交换细胞内外液。
4.盖上盖子，在30℃的培养箱中保存20分钟。
5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。
6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的od值。
7.空白管：4ml H2O+2ml磺酰胺溶液+2ml萘乙二胺溶液？在室温下放置15分钟后，在540nm处用分光光度法测定亚硝酸的OD值。
五、实验数据记录和处理称重：处理过的幼苗0.51g；对照苗0.50god值：处理苗0.513a；对照苗0.050aNO2含量标准曲线：y=257.29x-4.8262（x=OD值；y=NO2含量（nmol））。
水氮耦合对西瓜生长和产量的影响
西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.）Matsum.et Nakai ）是葫芦科西瓜属植物。
西瓜清爽解渴，味道甘味多汁，堪称“盛夏之王”，西瓜含有丰富的维生素C、蛋白氨基酸、果糖、葡萄糖、苹果酸等物质，极具营养价值。
我国是西瓜生产与消费的第一大国[1]。
近年来，随着人们生活水平的提高，对西瓜的数量和质量需求不断增加。
因此，提高西瓜产量和质量成为重要的研究任务。
提高西瓜产量和质量不仅依赖于优良品质的选育，还有赖于栽培管理技术，其中水肥管理是西瓜种植过程中最为重要的环节[2]。
水是植物进行物质转化、养分运输的重要条件，在植物光合、形态建成和生长发育中发挥重要的作用[3]。
氮作为作物生长发育所必需的营养元素其中之一，是作物生长的首要限制因素[4]。
植物蛋白质、核酸、酶和叶绿素合成需要氮素，氮素也是内源激素及其前体的主要成分[5]。
植物水和氮的吸收是两个相对独立的过程，但是存在相互的作用和联系，水氮的协调利用是植物物质积累的重要因素[6]，水分通过改善土壤物理化学特征以及土壤生物的活动来增加土壤养分的有效性，土壤养分伴随水分进入植物体内。
因此，协调的水氮关系能够促进植物养分运输、光合作用[7]。
苗为伟等[8]研究表明，施氮肥能够提高缺水环境下植物体内无机离子和有机物质含量，从而改善植株水分状况，提高对环境的适应能力。
马慧敏等[9]研究表明，氮代谢和光合作用对水分和氮素的响应存在差异，充足灌水有利于植物光合作用。
董伟欣等[10]研究表明，随着水氮量的增加，小麦株高、旗叶面积和地上部干重增加，中氮/高水是最理想的水氮互作方式。
前人有关水分和氮肥的研究取得较大的进展，然而有关水氮耦合互作对西瓜生长和产量的影响研究较少，因此，本试验设置3个氮肥水平和2个灌水水平，研究西瓜生长、氮代谢、光合参数以及产量的变化特征，为西瓜的高效栽培提供参考依据。
1 材料与方法1.1 试验材料试验于2021年江苏省淮安市淮安区石塘镇大棚内进行，属于亚热带湿润季风气候，平均气温为14.5℃，年平均在957mm，无霜期216d左右，全年日照时数2136-2411h，整体表现为雨热同季，雨量集中，冬冷夏热，光能充足，热量丰富。
不同氮肥类型及施氮量对大豆产量和品质的影响
不同氮肥类型及施氮量对大豆产量和品质的影响0 引言大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］是豆科大豆属植物，在我国栽培历史悠久，是我国重要的粮食作物和油料作物。
大豆含有丰富的脂肪、蛋白质、膳食纤维等，具有较高的营养价值。
当前，我国是世界上最大的大豆进口国，对大豆的需求量较大。
因此，大力发展大豆种植业，提高大豆产量和品质至关重要。
氮素是大豆形成新器官和生成籽粒蛋白质的原料，并参与蛋白质合成过程，是影响大豆产量的主要因素。
土壤中的氮素以多种形态存在，植物能够吸收利用的主要是铵态氮、硝态氮及一些可溶性有机氮分子。
酰胺态氮属于有机氮肥，需要经过土壤中的脲酶作用，水解成碳酸铵或碳酸氢铵后才能被植物吸收利用。
植物对不同形态氮素的吸收、运输机制不同，而且其同化效率也存在很大差异。
大量研究表明，氮肥类型能够影响植株对氮元素的吸收和利用效率，进而影响植物地上部分生长。
氮肥类型还会影响植物对其他矿质元素的吸收，主要是因为不同类型氮肥的生理酸碱性存在差异，会导致植物根际土壤pH值发生变化，进而使植物根系对其他阴离子和阳离子的吸收比例发生变化。
因此，笔者通过试验研究不同氮肥类型及施氮量对大豆产量和品质的影响，探寻适宜大豆生长的氮肥形态，从而为大豆种植管理提供科学依据。
1 试验材料与方法1.1 试验地概况试验地位于安徽省利辛县，属暖温带半湿润气候区，年平均气温14.9 ℃，年平均日照时间2 184 h，年无霜期213 d 左右，年平均降水量831 mm。
试验地土壤类型为砂姜黑土，耕层土壤有机质含量为13.8 g/kg，全氮含量为0.57 g/kg，速效磷含量为32.18 mg/kg，速效钾含量为105.72 mg/kg。
1.2 试验材料供试大豆品种为皖豆24。
试验用酰胺态氮肥为尿素，硝态氮肥为硝酸钾，磷肥为过磷酸钙，钾肥为氯化钾，均购于当地农资市场。
1.3 试验设计试验采用完全随机设计，设7 个处理（含1 个对照），以不施氮肥为对照（CK），N1～N6为6个施氮处理，其中N1为施用酰胺态氮肥40 kg/hm2、N2为施用酰胺态氮肥70 kg/hm2、N3为施用酰胺态氮肥100 kg/hm2、N4为施用硝态氮肥40 kg/hm2、N5为施用硝态氮肥70 kg/hm2、N6为施用硝态氮肥100kg/hm2。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
实验八硝酸还原酶活性的测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
01
实验目的
了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，负责 将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是植物和 微生物进行氮代谢的重要酶之一。
了解硝酸还原酶的特性，有助于深入 理解氮代谢的生物学过程，为农业生 产、生物固氮等领域提供理论支持。
预期结果
在实验前，根据相关文献和理论知识，预测实验 结果并制定预期目标。
结果比较
将实际实验结果与预期结果进行比较，分析两者 之间的差异和一致性。
结果分析
根据比较结果，分析实验中可能存在的问题和误 差来源，提出改进措施和建议。
05
结论与讨论
实验结论总结
硝酸还原酶活性在不同植物组织中存在 差异，表明该酶在不同组织中的功能和 作用可能有所不同。
03
04
在试管中加入适量的酶 液和硝酸盐底物。
将试管放入恒温水浴中， 设定适宜的温度进行反 应。
在反应过程中，定时取 样检测亚硝酸盐的生成 量。
通过分光光度计测定亚 硝酸盐的吸光度值，记 录数据。
数据记录和处理
1
记录每个取样的时间、亚硝酸盐的吸光度值。
2
根据吸光度值绘制亚硝酸盐生成曲线，计算酶活 性。
3
分析实验数据，得出硝酸还原酶活性测定的结果。
04
实验结果与分析
实验数据记录
实验数据记录表
在实验过程中，需要详细记录每 个实验步骤的实验数据，包括酶 液浓度、反应时间、反应温度等。
数据记录的准确性
确保实验数据的准确性是至关重 要的，因此需要使用精确的测量 工具和可靠的记录方法。
GS,GOGAT,GDH等酶活性测定最终版
提取方法2：Zhang CF, Peng SB, Peng XX, Chavez AQ,Bennett J. Response of glutamine synthetase isoforms to nitrogen sources in rice Oryza Sativa.L roots.Plant Sci,1997,125:163-170Rhodes D, Rendo GA, Stewart GR. The control of glutamine synthetase level in Lemna minor L. Planta, 1975, 125:201-211The reaction mixture (3.0 ml) consistedof sodium ketoglutarate (10_mol), ammonium chloride(10_mol), calcium chloride (10_mol), NADH (2_mol), Tris–HClbuffer (100_mol, pH 8.2) and enzyme 0.1 ml.Following a 30 min incubation period at 30◦C in 20μmol MgSO4, 80μmol α-ketoglutarate, 6μmol hydroxylamine, 8μmol ATP and enzyme extract, the enzymatic reaction was terminated by the addition of 1.5 ml of a solution containing 0.37mol/l FeCl3, 0.2 mol/l TCA and 0.37 mol/l HCl andthe amount of glutamyl hydroxamate determined at 540 nm.Lea P J, Blackwell R D, Chen F L. Enzymes of primary metabolism. In: Harborne J B.Methods in Plant Biochemistry. Vol.3. New York: Academic Press, 1990. pp 260-273the reaction mixture (3 ml) consisted of 5μmo l α-ketoglutarate, 1μmol potassium chloride, 48.75μmol Tris–HCl buffer (pH 7.6), 0.6μmol NADH, 0.3 ml enzyme and 8μmol L-glutamine300μmol Tris–HCl buffer (pH 8.0), 600μmol ammonium chloride, 3μmol calcium chloride, 0.6μmol NADH, and 0.1 ml enzyme. The change of absorption value was detected at 340 nm in 3 min,Singh RD, Srivastava H S. Increase in glutamate synthase (NADH) activity in maize seedlings in response to nitrate and ammonium nitrogen. Physiol. Plant, 1986, 66:413-416Loulakakis KA, Roubelakis-Angelakis KA. Intracellular localization and properties of NADH–glutamate dehydrogenase form Vitis vinifera L.: Purification and characterization of the major leaf isoenzyme.Journal of Experimental Botany, 1990, 41:1223-1230EP酶活性的测定高玲, 叶茂炳‘ 张荣铣“ 徐朗莱, 小麦旗叶老化期间的内肤酶植物生理学报,1998,24（2）183-188硝酸还原酶活性的测定：仪器：离心机；分光光度计；冰箱；研钵；试管等试剂：亚硝酸钠；Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；磺胺；浓盐酸；萘基乙烯胺；KNO3K2HPO4·3H2O；半胱氨酸；EDTA；NADH（辅酶Ⅰ）；李合生主编，植物生理生化实验原理和技术，高等教育出版社，2000,125-127 Li H-S(李合生). Experimental Principle and Technique for Plant Physiology and Biochemistry (植物生理生化实验原理和技术).Beijing: Higher Education Press, 2000. pp 125-127 (in Chinese)关于您问的“磷酸缓冲液里该加多少EDTA和半胱氨酸，均没有说明”在此书的P126页写的很全面，步骤也非常详细，请查阅，如：提取缓冲液。
碳氮代谢测定
谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是碳氮代谢的关键酶。
淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。
也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。
【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。
【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。
称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。