Folin-酚比色法测定蛋白质含量
2-folin-酚试剂法测定蛋白质含量
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绘制标准曲线-1
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标， 用铅笔绘制标准曲线。
吸光度A
0.6 0.4 .
.
.
0.2 . 40 80 120 160 蛋白质浓度C（μg/ml）
（要写图题）
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绘制标准曲线-2
根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲 线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线 不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实 验点均匀分布在曲线或直线两侧。
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复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何 注意？
请将答案附在实验报告上！
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值日生工作
实验完毕，组长登记实验室使用记录。 关闭仪器电源。
清洁、归整实验台面，扫地、倒垃圾。
回收试剂：将血清、Folin-酚试剂、牛血清白蛋白标准液 试剂收回放至准备室冰箱。 碱性硫酸酮试剂（每天最后实验的专业负责倾倒并清洗干 净，将试剂瓶放至准备室）。
注意事项2
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操 作必须精确控制时间。
即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时 ，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第3支试管，以此类推。 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1 支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2 支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试 管，以此类推。
什么是双缩脲反应？
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2） ，因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发 生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物。
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量Folin-酚试剂法测定蛋白质含量一、实验目的1，掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其具体实验操作技术；2，掌握制作标准曲线的要领；3，学会通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。
二、实验原理1，蛋白质分子中含有的肽键在碱性条件下可以与Cu2+螯合形成蛋白质- Cu2+复合物，即发生双缩脲反应。
而此复合物中的含酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基可以还原Folin-酚试剂的磷钼酸盐-磷钨酸盐，产生蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），即发生Folin-酚显色反应。
同时，在碱性条件下Folin-酚试剂极不稳定，从而易被蛋白质还原而呈蓝色反应。
2，在一定浓度范围内，蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。
故通过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线，以此绘制的标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。
三、材料和方法样品：健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L试剂：牛血清白蛋白标准液（200µg/ml）；碱性硫酸铜溶液（现配）；Folin-酚试剂仪器与器材： V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸实验步骤示意详细步骤A ，配置一定浓度梯度溶液: 取6支试管分别编号1至6，按下表加样。
（1作空白对照，2-5作标准，6为待测样品）1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于一号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml 后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。
如此类推混匀并将其静置在室温下。
2，在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样10分钟后，于第1支试管立即加入0.20mL Folin-酚试剂，并于2s 内摇匀。
1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。
B ，加样完毕后将各试管每隔1min 按1-6顺序放一只试管入水浴箱，分别40℃水浴10min 后取出冷却至室温。
folin酚法测定蛋白质含量
folin酚法测定蛋白质含量Folin-酚法是一种测定蛋白质含量的经典方法，其历史可以追溯到1948年。
此方法的基本原理是酚类物质在碱性条件下与蛋白质反应，生成一种深蓝色的复合物，该复合物在760nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比，因此可以通过测定吸光度来计算蛋白质浓度。
以下是Folin-酚法测定蛋白质含量的详细步骤：一、实验准备1.实验材料：o待测样品（蛋白质溶液）o Na2CO3o NaHCO3o硫酸铜o酒石酸钾钠o氯仿o无水乙醇o磷酸二氢钾o氢氧化钠2.实验设备：o分光光度计o研钵或电动搅拌器o漏斗和滤纸o玻璃试管和试管架o移液管o搅拌棒二、实验步骤3.准备Folin-酚试剂：将10g的酒石酸钾钠与50g的Na2CO3、NaHCO3混合在研钵中，充分研磨后转移至烧杯中，加入80ml的蒸馏水，搅拌至溶解。
将溶液煮沸并保持1分钟，然后冷却至室温。
将混合物转移至1L容量瓶中，用蒸馏水定容至1L。
4.取1ml待测蛋白质溶液（约0.01-1mg蛋白质）加入到试管中。
5.向试管中加入5ml Folin-酚试剂，混匀。
6.将混合物在室温下保持30分钟，期间不时搅拌。
7.在760nm波长下，用分光光度计测定混合物的吸光度。
为了获得更准确的结果，可以以蒸馏水为空白对照调零。
8.根据标准曲线计算蛋白质浓度。
可以通过绘制已知蛋白质浓度与其对应的吸光度的曲线图来制作标准曲线。
根据待测样品的吸光度，可以在曲线上找到对应的蛋白质浓度。
9.根据需要，可以进一步计算蛋白质的含量（mg/mL或mg/g）。
三、注意事项和局限性1.Folin-酚法对碱性环境非常敏感，如果在试剂准备和混合过程中出现不慎或操作不当，可能会影响到最终的测定结果。
因此，操作者需要熟练和准确的掌握该方法的操作步骤。
2.本方法不适用于测定含有大量酚类物质或还原性物质的样品，这些物质可能会干扰蛋白质与Folin-酚试剂的反应，导致结果偏差。
3.一些蛋白质的氨基酸序列中含有酪氨酸或色氨酸残基，这些残基可以与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，导致吸光度偏高，最终结果可能偏高也可能偏低。
蛋白质含量测定方法folin—酚试剂法
蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘，与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。
由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比，因此可以通过比色法测定蛋白质含量。
步骤：1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液（从低到高），并设置空白对照。
2. 取一定量的Folin试剂和样品混合，充分摇匀后静置2-3分钟。
3. 用酚试剂对样品进行稀释，制备出一系列浓度的标准样品。
4. 对比观察各标准样品的颜色变化，找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
5. 绘制标准曲线，再用于样品蛋白质的测定。
6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色，求出样品中的蛋白质含量。
注意事项：1. 必须严格控制反应温度和时间，以免影响测定的准确度。
2. 在加入Folin试剂后，需要摇动几次以确保充分反应。
3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质，需要事先进行去除或中和。
4. 对于浓度过高的样品，建议先进行稀释再进行测定。
在实践中，除了遵循以上步骤，还可以参考以下技巧和经验：* 使用干净的玻璃器具来操作，避免使用塑料器具导致的颜色干扰。
* 在加入Folin试剂后，可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。
* 在绘制标准曲线时，可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品，这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
* 对于未知样品，可以先进行预实验，大致确定蛋白质浓度范围，以便更好地控制实验进程。
总之，Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法，通过遵循正确的步骤和注意事项，可以获得较为准确的测定结果。
【2017年整理】Folin-酚比色法测定蛋白质含量
实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量一. 目的学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。
在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。
该方法灵敏度高，测定范围为25μg～250μg，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。
注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。
三. 实验材料及设备1. 材料绿豆芽2. 仪器分光光度计电子天平3. 器材普通试管：20mL×8容量瓶：100mL×1移液管：1mL×4 5mL×1烧杯：250mL×1 50mL×1滤纸：φ11cm滴管： 2洗耳球： 2坐标纸研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（250μg/mL）精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2. Folin-酚试剂甲●溶液A：Na2CO310gNaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL；酒石酸钾钠0.25g●溶液B：CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL；●使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。
该混合液只能保持一天。
3. Folin-酚试剂乙●在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。
folin酚试剂法测定蛋白质含量
注意事项2
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操 作必须精确控制时间。
– 即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时 ，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第3支试管，以此类推。 – 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1 支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2 支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试 管，以此类推。
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选择测定方法时应考虑
实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质；
溶液中存在的干扰物质；
测定所花费的时间等。
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本法概述
1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基（酚基）与还原酚试剂（磷钨酸 -磷 钼酸）起蓝色反应。 1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加 碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
试剂
1.牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）
2.碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3.Folin-酚试剂
仪器与器材
1.V-1100分光光度计
2.恒温水浴箱 3.试管6支、试管架 4.加样枪、加样枪架
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操作步骤
取6支试管，做好标记，按下表顺序操作：
加入物（ml） 1 2 3 4 5 6
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V-1100分光光度计操作步骤
开机，预热30分钟 转动波长旋钮，调所需波长。按 将黑体放入光路中，合上盖，按
MODE 0%
键切换到T档 键校零
开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上 盖，按 键切换到A档 MODE
Folin-酚法测定蛋白质含量
实验报告综合试验(三Folin-酚法测定蛋白质含量2010年 6 月3日摘要:本实验包括两个步骤,第一个步骤为制作标准曲线,第二个步骤为制备样品(牛奶和酪蛋白粗制品并用Folin —酚法进行蛋白质含量的测定,得到酶原液蛋白含量为8923 (ug/ml;洗脱峰Ⅰ蛋白含量82.692(ug/ml;洗脱峰Ⅱ蛋白含量121.923(ug/ml; 洗脱峰Ⅲ蛋白含量83.077(ug/ml。
此次实验与理论值仍存着一定的偏差。
通过本次实验的操作以及对实验结果的分析,了解Folin —酚法准确测定蛋白含量的原理方法,以及其相关的影响因素。
一、实验目的:1、测定实验中原液和洗脱液中蛋白质的含量2、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
3、熟悉分光光度计的操作。
二、理论背景:Folin-酚试剂法包括两步反应:第一步是在碱性条件下, 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物; 第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin 试剂还原, 产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物,颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100 倍,定量范围为5~100μg蛋白质。
Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起, 因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。
此外, 不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
三、实验装置:1. 实验材料原液, 洗脱峰2. 仪器(1移液管(0.5mL 、1mL 、5mL (2量筒(3 分光光度计(4 移液管、移液枪3. 试剂(纯度均为分析纯(1 0. 5mol/L NaOH(2 试剂甲:(A 称取10g Na2CO 3, 2g NaOH和0.25g 酒石酸钾钠,溶解后用蒸馏水定容至500mL 。
(B 称取0.5g CuSO 45·H 2O ,溶解后用蒸馏水定容至100mL 。
每次使用前将(A 液50份与(B 液1份,即为试剂甲,其有效期为1d ,过期失效。
Folin-酚法测定蛋白质含量
实验二 Folin-酚法测定蛋白质含量一、目的要求了解Folin–酚法测定蛋白质的原理，掌握Folin–酚法测定蛋白质含量的分析方法。
二、实验原理用化学法测定蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法、双缩脲比色法、Folin–酚比色法、考马斯亮蓝比色法等。
凯氏定氮法多用于贮存蛋白的测定；后者常用于可溶性蛋白的含量分析，它们具有操作简便，迅速，可适合一般实验要求的特点。
其中Folin–酚法较双缩脲法灵敏100倍，与考马斯亮蓝比色法灵敏度相似，但干扰物对检测方法的影响不相同，选用时应予考虑。
Folin–酚试剂由甲、乙两部分组成。
作用机理是：首先蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，生成铜—蛋白质复合物；然后该复合物还原磷钼酸—磷钨酸试剂，产生蓝色反应，其呈色强度与蛋白质含量成正比。
所测定蛋白质样品中若含有酚及柠檬酸均对实验有干扰。
浓度较低的尿素（约0.5%），三氯乙酸（约0.5%），乙醇（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响。
若样品酸度较高，需提高碳酸钠—氢氧化钠溶液浓度1–2倍。
三、试剂和仪器（一）试剂1、酪蛋白标准溶液：称取50mg酪蛋白（预先用凯氏定氮法测定蛋白质含量），加30mL 0.05mol/L NaOH ，于磁力搅拌器下溶解，补加0.05mol/L NaOH 至100 mL。
酪蛋白含量0.5 mg/ mL。
2、Folin-酚试剂试剂甲：（1）4% Na2CO3；（2）0.2 mol/L NaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸钾钠溶液。
使用前，将（1）与（2）以等体积混合配置成Na2CO3–NaOH溶液；（3）与（4）以等体积混合，配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液；然后将这两种溶液以50:1的体积混合，即为Folin–酚试剂甲。
该试剂只能用一天，过期失效。
试剂乙：在1000 mL磨口回流装置内加入50g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O），12.5g 钼酸钠（Na2M O O4·2H2O），350 mL 85%磷酸，50 mL浓盐酸，混匀。
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实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量
一. 目的
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法
二. 原理
Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。
在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。
该方法灵敏度高，测定范围为25μg～250μg，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。
注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。
三. 实验材料及设备
1. 材料
绿豆芽
2. 仪器
分光光度计电子天平
3. 器材
普通试管：20mL×8
容量瓶：100mL×1
移液管：1mL×4 5mL×1
烧杯：250mL×1 50mL×1
滤纸：φ11cm
滴管： 2
洗耳球： 2
坐标纸
研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1
四. 试剂的配制
1. 牛血清白蛋白标准液（250μg/mL）
精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
2. Folin-酚试剂甲
●溶液A：Na2CO310g
NaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL；
酒石酸钾钠0.25g
●溶液B：CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL；
●使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。
该混合液只能保持一天。
3. Folin-酚试剂乙
●在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠
(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。
●回流结束后，趁热加入150g硫酸锂、50mL蒸馏水及数滴液体溴，再继续开口沸腾
15分钟，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。
（若仍呈绿色，须重复滴加液体溴，再沸腾15分钟，直至呈黄色。
）
●用蒸馏水定容到1000mL；过滤；用棕色试剂瓶保存。
●使用前稀释1倍，使其最终浓度相当于1N酸。
五. 操作步骤
1. 样品液的制备
(1) 取材：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g左右，准确记录其质量。
(2) 研磨：将取得的材料置于研钵中，研磨成匀浆。
(3) 过滤：将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤，收集滤液；
用约10mL蒸馏水分三次洗涤研钵，洗涤液也过滤并收集其滤液。
(4) 定容：将滤液用蒸馏水定容到100mL，作为样品待测液。
2. 标准曲线制作及样品测定
取8支试管，按下表所示顺序操作。
六. 结果处理
1. 由0～5号管的数据，以蛋白质含量(μg)为横坐标，A500为纵坐标，在坐标纸上绘制标
准曲线；
2. 求两个样品管A500的平均值—A500；
3. 由—A500从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(μg)；
4. 计算你所取生物材料中蛋白质的百分含量。