大肠杆菌表达蛋白基础知识l
大肠杆菌表达蛋白酶
大肠杆菌表达蛋白酶大肠杆菌表达蛋白酶是指在大肠杆菌（Escherichia col i）中表达的蛋白酶，这些蛋白酶可以是细菌自身的酶，也可以是外源基因在大肠杆菌中表达的酶。
大肠杆菌作为一种常用的宿主细胞，在基因工程和生物技术中被广泛用于蛋白质表达。
以下是一些关于大肠杆菌表达蛋白酶的要点。
1.内源蛋白酶：大肠杆菌自身产生多种蛋白酶，这些酶在细菌的生长和代谢过程中发挥作用，如负责细胞内蛋白质降解的Lon酶和ClpP酶。
2.外源蛋白酶表达：外源蛋白酶基因可以通过基因克隆技术插入到大肠杆菌的质粒或染色体中，然后通过转录和翻译过程在大肠杆菌中表达。
为了提高外源蛋白酶的表达水平，常使用强启动子和优化密码子使用。
3.表达系统的选择：大肠杆菌表达系统有多种类型，如T7表达系统、Lac 和Tac表达系统、PL和PR表达系统等，不同的系统具有不同的特点和适用场景。
4.优化表达条件：为了提高蛋白酶的表达效率和活性，需要优化培养条件，如温度、pH、氧气供应、诱导剂的使用等。
5.蛋白质折叠和修饰：外源蛋白酶在大肠杆菌中表达后，可能需要适当的折叠和后翻译修饰才能获得活性。
这可能需要在表达过程中添加辅助因子或在表达后进行体外修饰。
6.蛋白酶的纯化和分析：表达的蛋白酶可以通过各种蛋白质纯化技术进行纯化，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
纯化后的蛋白酶可以进行活性分析、结构分析等进一步研究。
7.应用：大肠杆菌表达蛋白酶在生物医药、农业、工业等领域有广泛的应用，例如在药物开发、疾病诊断、生物催化等方面。
大肠杆菌表达蛋白酶的研究和应用是生物技术领域的一个重要分支，对于理解蛋白质的功能、结构和相互作用具有重要意义，同时也为生物制药和生物工程提供了重要的工具。
蛋白表达概述
缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。
昆虫细胞表达系统
利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。
优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源 DNA 插入，因此是表达大片段 DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。
选择合适的载体需要考虑的因素： ?目的蛋白的应用 ?目的蛋白已知特定信息 ?克隆策略
目的蛋白的应用
分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制 备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多 种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是， 能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要 连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的 组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
?对于我们来说，最常用和最需掌握的是 大肠杆菌表达系统
Factors in E.coli protein expression
vector
Strain
growth conditions
一个蛋白要成功的在 E.coli 系统表达，就是要根据表达目的在 载体，菌株和培养条件 三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到 ⑴目的基因的表达产量高 ;⑵表达产物稳 定;⑶生物活性高 ;⑷表达产物容易分离纯化。
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
8。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚,目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具.因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的.本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点,归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验,总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1。
1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子,如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等.根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性,促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化,或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly—Arg,Poly—His, Strep—Tag Ⅱ，S—tag，MBP等.其中His—Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S—转移酶是另一种实验室常用的融合标签.它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化.此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠,提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。
大肠杆菌蛋白表达
大肠杆菌蛋白表达
大肠杆菌蛋白表达是一种常用的蛋白质表达技术，通过将目标蛋白的编码基因插入大肠杆菌表达载体中，利用大肠杆菌的代谢途径和生理特性，在大肠杆菌中高效表达目标蛋白。
在大肠杆菌蛋白表达中，选择合适的表达载体和宿主菌株是关键。
一般选择具有高复制数和强表达能力的表达载体，如pET、pGEX等。
同时，宿主菌株应该具有高转化效率、良好的生长性能和表达稳定性。
在大肠杆菌蛋白表达过程中，还需要考虑到目标蛋白的结构和功能等因素。
如对于分泌型蛋白，需要加入信号肽序列实现分泌；对于复杂结构的蛋白，需要考虑到正确折叠和修饰等问题。
大肠杆菌蛋白表达技术的优点是简单易行、高效快速、表达水平可控，并且可用于大规模蛋白质生产。
因此，大肠杆菌蛋白表达技术在生物医学、生物工程和生物材料等领域得到了广泛应用。
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大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如入PL, cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc ，tac，T5/lac operator ，T5/lac operator 等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag II，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Ci2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。
除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。
此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。
原核大肠杆菌蛋白表达
原核大肠杆菌蛋白表达系统是一种常用的表达系统，它基于细菌细胞（通常为大肠杆菌）对外源基因的转录和翻译过程。
在表达载体中，包含有启动子、激活子和选择子等元件，这些元件使得外源基因能够被细菌细胞识别、转录成mRNA，并通过翻译过程合成目标蛋白。
大肠杆菌表达载体的要求如下：
1. 操纵子以及相应的调控序列，因为外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用。
2. SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7\~13bp翻译效率最高。
3. 多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。
此外，目的基因在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因。
原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因含有内含子不能直接表达，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。
同时还需要提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
大肠杆菌的基本知识概述
大肠杆菌的基本知识概述作者：肖安庆来源：《中学生物学》2010年第11期大肠杆菌是重要的模式生物,在高中生物学中有.多处知识涉及到,如原核生物的基本结构与分裂、T2’噬菌体侵染细菌实验、基因工程常见运载体、大肠杆菌的鉴定、微生物的酶合成调节等。
这些知识涉及点多,分布零散,缺乏系统性,下面就大肠杆菌的基本知识作简要概述。
1认识大肠杆菌的基本历程大肠杆菌是大肠埃希氏菌的俗称,属肠杆菌科埃希氏菌属,1885年埃舍利希氏首次发现。
在相当长的时间内,人们一直把它当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。
直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼禽,常引起严重腹泻和败血症。
根据不同的生物学特性,将致病性大肠杆菌分为5类:致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。
2大肠杆菌的基本结构2.1细胞壁大肠杆菌的细胞壁厚约11μm,分外膜和肽聚糖层。
外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分,占细胞壁干重80%,位于肽聚糖层的外侧,主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。
脂多糖是革兰氏阴性细菌的内毒素,也是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有成分,主要与抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关。
肽聚糖层由1—2层网状的肽聚糖组成,占细胞壁干重的10%,是细菌特有的成分,由聚糖链、短肽和肽桥三部分组成。
由,脂蛋白将外膜和肽聚糖层连接起来,从而使大肠杆菌的细胞壁形成一个整体结构。
2.2细胞膜大肠杆菌的细胞膜与其他生物细胞膜的结构相似,但上面的蛋白质含量高、种类多,具有选择透性,可控制营养物质进出细胞。
大肠杆菌的细胞膜含有丰富的酶系,是大肠杆菌的能量转化的场所,参与细胞壁的合成。
2.3细胞质大肠杆菌的细胞质含有糖原颗粒、核糖体和质粒等结构。
2.3.1核糖体大肠杆菌的核糖体包含两个亚基,即50S亚基(23S rRNA、5S rRNA、34种蛋白质)和.30S亚基[16SrRNA、21种蛋白质(S1～S21)]。
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program
Advantages
• Fast growth • Cheap medium and equipment for growing • Good knowledge of the host
RBS
RBS 5-9 n START
GAAGGAATTCAGGAGCCCTTCACCATG ... ...
START codons: E. coli uses 77% ATG (AUG), 14% GTG (GUG), 8% TTG (UUG) and a few others STOP codons: TAG (UAG), TGA (UGA), TAA (UAA)
Combinations
Genetic Elements Essential for Expression
Replication Origin
Plasmid pBR322
pUC pACYC pSC101 colE1
Replicon pMB1 pUC p15A pSC101 colE1
Copy Number 15-20
Key features
Plac Low level up to middle (IPTG)
Ptac Ptrc
Moderately high (IPTG)
(trp-lac)
Weak, regulated. Suitable for expression of gene products at very low intracellular level. Comparatively expensive induction.
Key features
T7 Very high
Utilizes T7 RNA polymerase.
T5 High
PL Moderately high (temperature shift)
Utilizes E. coli RNA polymerase.
Temperature-sensitive host required. Less likelihood of "leaky" un-induced expression. Basal level; high basal level by temperatures below 30°C. No inducer.
500-700 18-22 5 15-20
Co-expression from two plasmids
Protein Expression in Bacteria Part2
1. Cloning strategies
2. Overview of the available expression systems and expression strains
Transcriptional vector
ApaLI (1121)
pTrc99
Translational vector
pQE
Translational vector + CDR
pET
pCR&pEXP
pBAD
Expression strains
# Strain
Key features
1 BL21
We may fuse the target protein with • various tags to facilitate its purification or detection
HHHHHH-target, epitope-target • highly soluble proteins to improve solubility and to
5 BL21-AI
#1 + carry T7 polymerase under PPBAD (araBAD) Enables T7 expression with tight regulation
6 BL21 CodonPlus- #1 + Enhances the expression of eukaryotic proteins that
Deficient in lon and ompT proteases
2 BL21* /STAR
#1 + deficient in RNaseE
Improves the stability of mRNA transcripts and increases
protein expression yield
Goals
To obtain
as much as possible /good expression+good cell growth
soluble folded protein
/reduced aggregation
in a form that is easy to purify /use of secretion and tags
Genetic Elements Essential for Expression
Promoters
Host’s promoters
2500 in the entire genome of E. coli K12 strain Most frequently used: Plac / Ptac / Ptrc, PPBAD, rhaPBAD - Regulation of expression
RIL
contain codons rarely used in E. coli: AGG, AGA, AUA, CUA
7 BL21 trxB
#1 + deficient of trxB
Facilitates cytoplasmic disulfide bond formation
Expression optimization
High-level, but lower than T7 system. Regulated expression still paratively expensive induction. High basal level.
PPBAD: Regulation
PPBAD and RhaPBAD
3. Design of cloning procedures using the VNTI program
Types of Expression Vectors
1 2
3
Insertion into Transcriptional Vectors
Insertion into Translational Vectors
•differences in post-translational modifications (SS bonds, glycosylation etc)
Disadvantages
Accumulation of lipopolysaccharides (generally referred to as endotoxins) …
Cloning Using Restriction Enzymes
NcoI
HindIII
Cloning Using A-overhangs
TA-Cloning with Topoisomerase
Directional Cloning
CACC
Gateway Technology
Expression of Fusion Proteins
rhaPBAD
Variable from low to high level
(L-rhamnose)
Tight regulation. Low basal activity. Relatively expensive inducer.
Phage Promoters
Level of expression (inductor)
3 BL21*(DE3)
#1 or 2 + carry T7 polymerase under Plac
Enables T7 expression
4 BL21*(DE3)pLysS/E #3 + plasmid pLysS or pLysE expressing T7 lysozyme
Reduces basal expression of recombinant genes
Promoters from phages
T7, T3, SP6, T5, PL - Highly efficient and specific expression
Plac: Regulation
Plac, Ptac, Ptrc: Characteristics
Level of expression (inductor)
Disadvantages
Limitation for expression of eukaryotic proteins due to:
•different frequencies with which the different codons appear in genes of these organisms
facilitate purification Thioredoxin-target, GST-target
• signal peptides or other proteins or domains to promote secretion SP-target
‘Short’ Fusion Protein Construction
E.g. CGT, CGC, CGG, AGG, AGA, CGA code for arginine, but the last 3 (AGG, AGA, CGA) are rarely used in E. coli and it has low amounts of respective tRNAs.