第10章 转基因植物
合集下载
第十章 生物环境-植物互作
10-20
20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80
<0.5 0.6-1.5 1.6-2.5 2.6-3.5 3.6-5.5 >5.6
80-90 90-100
g/500 cm3
3
小麦—玉米间作体系中玉米根重的分布
0-10
10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90
20-30
30-40
40-50
50-60
60-70
70-80
<0.5 0.6-1.5 1.6-2.5 2.6-3.5 3.6-5.5 >5.6
g/500 cm3
小麦—玉米间作体系中小麦根重的分布
(19, June)
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 0-10
不同小麦品种在无杂草时的产量潜力和对瑞 士黑麦草的抗性的关系
与杂草竞争时的产量损失率 %
Lemerle et al. 2001. Genetic improvement and agronomy for enhanced wheat competitiveness with weeds. Aust. J. Agric. Res. 52: 527–548.
g/500 cm3
杂草：成功的秘诀是 什么？
慢生 速生
茎和生 殖结构
速生型与慢生 型丛生禾草的 物质分配塑性
(plasticity)
根
相似
Tradeoff：一些 性状塑性高则另 一些性状塑性低
竞争性杂草莫邪菊对两 种单冠菊侧根分布的影
响
RGR 的频度分布
农业转基因生物安全管理条例
农业转基因生物安全管理条例（20XX年5月23日中华人民共和国国务院令第304号发布根据20XX年1月8日《国务院令关于废止和修改部分行政法规的决定》修订根据20XX年10月7日《国务院关于修改部分行政法规的决定》修订）第一章总则第一条为了加强农业转基因生物安全管理，保障人体健康和动植物、微生物安全，保护生态环境，促进农业转基因生物技术研究，制定本条例。
第二条在中华人民共和国境内从事农业转基因生物的研究、试验、生产、加工、经营和进口、出口活动，必须遵守本条例。
第三条本条例所称农业转基因生物，是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品，主要包括：（一）转基因动植物（含种子、种畜禽、水产苗种）和微生物；（二）转基因动植物、微生物产品；（三）转基因农产品的直接加工品；（四）含有转基因动植物、微生物或者其产品成分的种子、种畜禽、水产苗种、农药、兽药、肥料和添加剂等产品。
本条例所称农业转基因生物安全，是指防范农业转基因生物对人类、动植物、微生物和生态环境构成的危险或者潜在风险。
第四条国务院农业行政主管部门负责全国农业转基因生物安全的监督管理工作。
县级以上地方各级人民政府农业行政主管部门负责本行政区域内的农业转基因生物安全的监督管理工作。
县级以上各级人民政府有关部门依照《中华人民共和国食品安全法》的有关规定，负责转基因食品安全的监督管理工作。
第五条国务院建立农业转基因生物安全管理部际联席会议制度。
农业转基因生物安全管理部际联席会议由农业、科技、环境保护、卫生、外经贸、检验检疫等有关部门的负责人组成，负责研究、协调农业转基因生物安全管理工作中的重大问题。
第六条国家对农业转基因生物安全实行分级管理评价制度。
农业转基因生物按照其对人类、动植物、微生物和生态环境的危险程度，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个等级。
具体划分标准由国务院农业行政主管部门制定。
第七条国家建立农业转基因生物安全评价制度。
园艺植物育种学_王小佳_第十章品种审定、新品种保护及良种推广精讲
一 品种审定
4 品种审定机构及其工作内容 4.1 审定机构 农业部设立国家农作物品种审定委员会，负责国家 级农作物品种审定。 省级农业行政主管部门设立省级农作物品种审定委 员会，负责省级农作物品种审定。 品种审定委员会成员由科研、教学、生产、推广、 管理、使用等方面的专业人员构成。
一 品种审定
4.2 工作任务及内容 • 领导、安排品种区域试验、生产试验工作，组 织现场观摩。 • 完成品种试验程序的品种，由品种审定委员会 办公室负责汇总试验结果，并提交品审委员会 专业委员会审定。 • 对已通过审定的发现有不可克服的缺点的品种， 品种审定委员会有权作出停止推广的决定。
二 植物新品种保护
4 授权品种权的权益和归属 4.1 完成育种的单位或者个人对其授权品种，享 有排他的独占权。 4.2 执行本单位的任务或者主要是利用本单位的 物质条件所完成的职务育种，属于该单位；非职 务育种，属于完成育种的个人。 4.3 委托育种或者合作育种，品种权的归属由当 事人在合同中约定；没有合同约定的，品种权属 于受委托完成或者共同完成育种的单位或者个人。
二 植物新品种保护
5 品种权的保护期限 品种权的保护期限，自授权之日起，藤本植物、林 木、果树和观赏树木为20年，其他植物为15年。
二 植物新品种保护
6 植物新品种保护和品种审定的关系 两者是两项性质不同的法规条例，规定需要品种 审定合格才能推广的作物种类，即使获得品种保 护权，在生产、销售、推广前仍需先通过品种审 定。
二 植物新品种保护
1 植物新品种保护的概念及意义 1.1 概念 指完成育种的单位或者个人对其授权品种享有 排他的独占权。任何单位或者个人未经品种权 所有人许可，不得为商业目的生产或者销售该 授权品种的繁殖材料，不得为商业目的将该授 权品种的繁殖材料重复使用于生产另一品种的 繁殖材料。 植物新品种保护也叫“植物育种者权利”，同 专利、商标、著作权一样，是知识产权保护的 一种形式。
第10篇 基因组表观遗传
核小体旋转定位
旋转定位（rotational position） 缠绕在核小体上的 DNA分子总是一面 朝外，一面朝内。 当移动缠绕在核小 体上的DNA时，若 改变的顺序少于整 圈螺旋碱基对数 （≠10.2 bp），原 有的顺序朝向将发 生变化。因朝外一 侧比朝内一侧更易 受到核酸酶的攻击， 采用合适的酶处理 可检测到这种变 副突变不涉 及基因结构 的改变,只是 等位基因的 表达模式不 同于原来的 同源基因.
副突变遗传效应
10.3 DNA甲基化与表观遗传
基因组的甲基化模式可影响表型并能通过 体细胞遗传,但不改变细胞的基因型.
A甲基转移酶主要存在于低等真核生物 C甲基转移酶主要存在于高等真核生物 两者都以SAM(S腺苷甲硫氨酸)为底物.
果蝇绝缘子（insulator）
果蝇多线染色体横纹区SCS 专一性结合蛋白质
Interband
Scs,
BEAF-32
绝缘子可阻止相邻基因之间 增强子的彼此干扰
1) 真核生物增强子具有双向作用, 超长距离功 能, 从而带来位置相邻基因之间的彼此干扰 问题. 2) 有些基因位与异染色质邻近, 会受到抑制效应 的干扰. 绝缘子可以阻止上述因位置原因产生的对基因表 达的抑制.
核小体平移定位
平移定位（translational position） 假定核小体与DNA的结合存在特 异性，当移动10 bp 倍数的顺序时，缠绕核小体的序列将会改变位置， 从而使核小体之间连接的顺序发生移位，但不改变DNA顺序原有的 朝向。 移位可使下一轮暴露的连接DNA顺序增加或减少。用微球菌 核酸酶处理样品，可发现移位的顺序 .
Acetylation Phosphorylation
Histone Substitution
第10章 植物遗传转化
8
农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了 共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞 作为靶材料。 操作简便。
21
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点：
1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
22
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体 材料进行遗传转化操作，然后经过培养直接在 外植体上形成不定芽的情况。 这种系统的特点是 1）获得再生植株的所 需时间短，操作简单；2）遗传变异少；3）外 源基因稳定性高；4）嵌合体比例偏高；5）受 植物物种的限制比较大。
25
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性 5，生殖细胞受体系统
以花粉粒或卵细胞为受体细胞进行直接的 转化的技术系统，也叫种质系统。 5.1，花粉管通道法； 5.2，花粉粒浸泡法； 5.3，花粉粒基因枪转化法； 5.4，子房微注射法。
26
第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
16
第二节
转化的受体系统
一、转化受体的条件
5，农杆菌敏感性 对于农杆菌介导的基因转化来说，需要受 体材料对农杆菌敏感，因为只有对农杆菌敏感 的材料才能够接受农杆菌的转化。一般认为， 大多数双子叶植物对农杆菌敏感而单子叶植物 不敏感。 农杆菌有不同的菌株，同一材料对不同菌 株的敏感程度可能存在不同；目前，还可以采 用化学试剂（乙酰丁香酮）来弥补敏感性的不 足。
第十章外源基因表达和基因工程药物
超螺旋构象 4.CpG岛甲基化水平降低
（二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子） 直接影响基因表达活性 （三）转录因子的调控 （四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和 功能，其在转录后层次不同于原核生物
目标蛋白性质
是否需要糖基化
三维结构复杂程度
是
否
简单结构
真核表达 系统
原核表达 系统
复杂的三维结构
• 目的：针对难以或无法从自然界直接提取、 分离、纯化所获得的，或制造成本、产量 规模等受限制的，或利用化学方法无法合 成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物， 利用细胞或组织或器官或生命体的复制、 转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、 修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生 物分子，并从中将表达产物分离纯化至预 期程度，最终加工成药品。
测序；表达图谱 4. 法医—犯罪现场标本分析 5. 肿瘤—各种肿瘤检测 6. 其他……
二、目的基因与表达载体的重组
• 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA 进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接 形成完整有复制能力的重组体。
（一）载体
• 对于外源基因的表达，第二个问题就是选 择合适的表达载体并将目的基因重组至表 达载体上。
第十章外源基因表达与基 因工程药物
第一节 概 述
• 外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控 系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白 质的过程。
• 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码 外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通 过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞 的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系 统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的 蛋白质。
• 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键 在于：选择合适的重组位点、剪切位点； 以及剪切后适当的条件将目的基因和载体 DNA分子连接获得重组分子。
（二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子） 直接影响基因表达活性 （三）转录因子的调控 （四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和 功能，其在转录后层次不同于原核生物
目标蛋白性质
是否需要糖基化
三维结构复杂程度
是
否
简单结构
真核表达 系统
原核表达 系统
复杂的三维结构
• 目的：针对难以或无法从自然界直接提取、 分离、纯化所获得的，或制造成本、产量 规模等受限制的，或利用化学方法无法合 成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物， 利用细胞或组织或器官或生命体的复制、 转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、 修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生 物分子，并从中将表达产物分离纯化至预 期程度，最终加工成药品。
测序；表达图谱 4. 法医—犯罪现场标本分析 5. 肿瘤—各种肿瘤检测 6. 其他……
二、目的基因与表达载体的重组
• 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA 进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接 形成完整有复制能力的重组体。
（一）载体
• 对于外源基因的表达，第二个问题就是选 择合适的表达载体并将目的基因重组至表 达载体上。
第十章外源基因表达与基 因工程药物
第一节 概 述
• 外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控 系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白 质的过程。
• 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码 外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通 过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞 的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系 统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的 蛋白质。
• 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键 在于：选择合适的重组位点、剪切位点； 以及剪切后适当的条件将目的基因和载体 DNA分子连接获得重组分子。
作物育种学重点
《作物育种学》教学重点一、大纲说明1．课程的性质、地位和任务《作物育种学》是研究选育和繁育农作物优良品种的理论和方法的科学，是农学专业的一门主要专业课程。
《作物育种学》具有综合性和实践性强的学科特点。
它以遗传学、进化论为主要基础，涉及植物学、植物生态学、植物生理学、生物化学、植物病理学、农业昆虫学、农业气象学、生物统计与试验设计、生物技术、农产品加工学等领域的知识与研究方法。
并与作物栽培学有着密切的联系，是作物生产科学的两个不可偏缺的主要学科。
通过本课程的学习，使学生理解选育和繁育农作物新品种的基本原理，初步掌握作物育种和良种繁育的技术方法和基本操作技能，初步具备综合应用本学科和相关学科的知识，独立开展作物育种和良种繁育工作的能力。
2．课程教学的基本要求课程教学贯彻理论与实践相结合的原则，实行课堂教学、实验教学、多媒体教学与田间实践相结合的方法，重视育种理论知识的传授，强化学生实践操作能力的培养。
以课堂讲授为主线，配合搞好实验课、教学实习、课程论文、教学标本园区的管理与调查、作物育种科研试验区观摩及作物原种、良种生产基点的考察等实践性教学环节。
课堂教学方法中，实行少而精、启发式和形象化教学相结合，通过多媒体等现代化教学手段提高学生对抽象内容的感性认识。
采用以上多种具体教学措施，提高学生参与作物育种和良种繁育等科研、生产实践活动的主动性和积极性，培养学生独立发现问题、分析问题和解决问题的能力。
3．课程简介（100字左右）课程内容包含了从制订作物育种目标到种子生产的全过程。
其中引种、选择育种、杂交育种、杂种优势利用、诱变育种、远缘杂交与倍性育种、生物技术在育种中的应用等途径，抗病虫育种、抗逆性育种、作物品质改良等主要目标性状的选育和良种繁育为本课重点。
4．课程教学改革课程教学突出知识的科学性、系统性、实用性和先进性。
学时压缩，内容精简调整。
压缩陈旧、重复内容，增加高新技术和实用性强的内容。
注意本课程知识与已开课程（如植物学、遗传学等）和后续课程（如组织培养）知识的衔接，避免不必要的重复。
第10章 微生物与基因工程
➢ 携带了氨卞青霉素抗性基因（ampR）
➢ 多克隆位点区位于lacZ‘基因中，在此位点上插入外源基因会 导致lacZ‘基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。
.
.
.
质粒的不足
（1）外源DNA≤15kb。 （2）转化效率低，约0.1％的转化率。
.
二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体的优点： （1）遗传背景清楚； （2）容纳外源DNA≤23kb。 （3）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。 缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位
.
.
⑵ 插入一小段多克隆位点区
➢ 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点 的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会 破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和 宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板 上，则形成无色噬菌斑。
.
➢ M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适 于克隆300～400bp的外源DNA片段；
.
M13噬菌体的改造
➢ 野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生 型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。
➢ 在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均 为复制和组装所必需的基因。
➢ 外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对 野生型M13的改造主要在IG区中进行。
.
⑴ 插入β－半乳糖苷酶选择标记
第十章
微生物与基因工程
基因工程技术
➢ 基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿 主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基 因产物，或令生物表现出新的形状。
.
基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，
➢ 多克隆位点区位于lacZ‘基因中，在此位点上插入外源基因会 导致lacZ‘基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。
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质粒的不足
（1）外源DNA≤15kb。 （2）转化效率低，约0.1％的转化率。
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二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体的优点： （1）遗传背景清楚； （2）容纳外源DNA≤23kb。 （3）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。 缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位
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⑵ 插入一小段多克隆位点区
➢ 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点 的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会 破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和 宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板 上，则形成无色噬菌斑。
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➢ M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适 于克隆300～400bp的外源DNA片段；
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M13噬菌体的改造
➢ 野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生 型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。
➢ 在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均 为复制和组装所必需的基因。
➢ 外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对 野生型M13的改造主要在IG区中进行。
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⑴ 插入β－半乳糖苷酶选择标记
第十章
微生物与基因工程
基因工程技术
➢ 基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿 主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基 因产物，或令生物表现出新的形状。
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基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，
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产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
一、转基因植物
2、载体 载体：是目的基因的运输工具，它
能将分离克隆得到的目的基因导入 植物细胞并使其整合到寄主染色体 组中得以表达。
一、转基因植物
载体种类：
（1）目的基因克隆载体：目的基因克隆载 体与微生物基因工程类同，通常是由多拷 贝的E.coli小质粒为载体，其功能是保存 和克隆目的基因。 （2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大 肠杆菌质粒插入T－DNA片段及目的基因、 标记基因等构建而成。它是构建中间表达 载体的基础质粒。 （3）中间表达载体：中间表达载体是含有 植物特异启动子的中间载体，其功能是作 为构建转化载体的质粒。
载体介导法
将根癌农杆菌与植物原生质体、悬浮细胞、 叶盘、茎段共同培养，用根癌农杆菌含有目 的基因的质粒去转化植物受体。
将短暂共培养的受体洗去根癌农杆菌在含有 适量抗生素的培养基上培养，筛选具有抗生 素抗性标记的转化细胞，然后用特定培养基 诱导这些细胞形成转基因植株。
这种方法适合双子叶植物，大多数单子叶植物 因为不能诱导Ti质位vir区基因表达信号分子， 应用受到限制。
发现农杆菌是与根癌农杆菌同属的一种 病原土壤杆菌，含有Ri质粒，可以诱导植物 细胞产生毛状根，毛状根细胞能分化形成植 株。
由于Ri质粒也含有可高效整合到植物受 体细胞的染色体上并得到表达的T-DNA，因 此也可用作转基因植物的载体。
花粉管通道法
花粉管通道法又称子房注射法，是在植 物授粉后，将外源DNA注人子房的胎座 位置，使DNA沿着花粉管通道进入胚囊 与受精卵或者胚细胞接触而达到转化目 的。
❖根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴 性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形 成肿瘤,即诱发冠瘿瘤。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段 转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移 进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为 植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传 给子代 。
➢PEG是细胞融合剂，在磷酸钙、高pH条
件下引起原生质细胞膜表面电荷紊乱带 来通透性改变从而有助于细胞摄取外源 DNA。
化学物质诱导法
PEG法优缺点较稳定、重
复性好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合 转化体很少产生。 缺点
➢原生质体培养再生难度较大 ➢原生质体再生培养的转化植株变异率高,易
一、转基因植物
（4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的 Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化 载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：植物基因转化 载体是最后用于目的基因导入植物细胞的 载体，故亦称工程载体。它是由中间表达 载体和卸甲载体构建而成。根据它的结构 特点又可分为两种转化载体，即一元载体 系统和双元载体系统。
➢ 第三个因素是受体材料的选择
一、转基因植物
基因枪法优点： ①不受受体种类限制，特别适合根瘤农 杆菌不能浸染的植物 ②简化了质粒构建，可以用两个或两个 以上的质粒进行共转化，而不需构建一 个复杂的质粒 ③快速简便，转化率较高。
化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于
特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的 方法。常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚 乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇) 等,其中PEG法应用较多,效果较好。
病毒感染法
病毒可以感染植物组织，不受双子叶和 单子叶限制，作为植物转荃因载体的病 毒包括单链RNA病毒、 单链DNA病毒和 双链DNA病毒。
较为成熟的是花椰菜花斑病毒（CaMV） 和番茄金花叶病(TGMV )。
转基因植物鉴定
一般情况下，在受体细胞群中只有少部 分细胞获得了外源目的基因，而目的基 因被整合到受体细胞基因组并实现表达 的更少。因此必须从转化体系中筛选出 含有目的基因的重组体。 ➢常用方法包括:选择性培养检测、报告
Ti plasmid---circular ds DNA about 200kb
载体介导法
目前已经建立的Ti质粒介导方法有共整合转化、 二元整合转化等。 (一)Ti质粒介导的共整合转化系统
将外源基因整合到修饰过的T-DNA上形成可 穿梭的共整合载体，在vir基因产物作用下完成 目的基因向植物细胞的转移和整合。
液体MS浸泡15min
无生长素N6-AS共培养 3d
N6-H选择培养20d
抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d
优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程
1 2N6愈伤诱导 2 N6-BA预培养 3 N6-H选择培养
4 植 株 再 生
载体介导法
根癌农杆菌转化植物细胞的过程大致包 括： 1、农杆菌对植物细胞表面特定部位的识 别和附着 2、经敏感细胞的诱导作用，位于Ti质粒 上控制T区的基因转移的Vir区基因活化 并表达 3、T-DNA从Ti质粒上切割下来，通过细 菌和植物细胞的壁，转移并整合到植物 细胞的核基因组中。
基因枪法
基因枪法进行遗传转化的步骤： 1、靶细胞或组织的预处理：渗透压
调节（甘露醇、山梨醇） 2、质粒DNA的提取与纯化 3、微弹头的制备（质粒DNA浓度、
金粉颗粒处理） 4、轰击 （距离、压力） 5、抗性愈伤组织的诱导与筛选 6、植株再生与转化体筛选
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
共整合载体和农杆菌质粒重组过程
Ti质粒介导的共整合转化系统
（1）将删除tms、tmr和tmt基因的T-DNA片段克 隆到大肠杆菌载体质粒pBR322上（有氨苄青霉素 抗性标记) （2）然后分别插人新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基 因(卡那霉素抗性)和根癌农杆菌筛选标记，接入 外源基因，转化大肠杆菌，利用氨苄青霉素 （Apr）筛选阳性克隆。
载体介导法
（二)Ti质拉介导的二元整合转化系统 由两个分别含有T-DNA和vir区的Ti微型
质粒和辅助质粒构成，通过反式激活T-DNA转 移至植物细胞基因组内。
微型Ti质粒小，转移到农杆菌比较容易， 载体容易构建，效率较高。这是目前T-DNA转 化植物细胞比较常用的方法。
Ti质拉介导的二元整合转化系统
T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA， 故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因 与肿瘤的形成有关。
载体介导法
农杆菌转化的方法 1、共培养法：包括原生质体共培养、悬 浮细胞共培养核愈伤组织共培养。
农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略
表面有伤口的外植体
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
显微注射法和激光微束法等。 化学方法包括PEG法、脂质法等。
一、转基因植物
基因枪法最早是由 美国康奈尔大学 Sanford最先提出的。 1992年，世界首例 转基因小鼠就是通 过该法获得的。
一、转基因植物
基因枪法(gene gun bombardment)又称粒子轰
击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术 (high-velocity particle microprojection)， 经过加速装置用表面附着DNA分子(含目的基因） 的金属微粒轰击植物细胞，将DNA直接射入植物 细胞。
一、转基因植物
技术路线
目的基因分离 植物表达载体的构建 受体材料的准备
遗传转化
炼苗
转化组织 转化植株筛选 组织脱分化
一、转基因植物
1、受体 受体材料的选择 （1）叶盘:从幼嫩新鲜的植物叶片上用
打孔器取下直径约5mm的圆形叶片 （叶盘）作为外源DNA的转入受体。 （2）原生质体:无细胞壁易于接受外源 基因，同时细胞璧再生后可以再生完 整植株。
一、转基因植物
（3）悬浮细胞:单个细胞易于操作， 性状稳定。
（4）愈伤组织:属于分生细胞，易于 接受外源基因。
（5）胚状体:胚状体起源于单细胞， 嵌合现象不易发生。
一、转基因植物
（6）活体:在植株上形成新鲜伤 口，接种根癌农杆菌转化载体， 得到再生芽。
（7）胚轴、茎尖、茎段等也可以 作为转化受体。
Ti质粒介导的共整合转化系统
（3）将重组大肠杆菌与含野生型Ti质粒的根癌 农杆菌进行结合，通过同源重组，T-DNA质粒整 合到Ti质粒上得到重组根癌农杆菌，利用根癌 农杆菌筛选标记筛选。 （4）将得到的整合型根癌农杆菌感染植物愈伤 组织，携带大肠杆菌重组质粒的T-DNA便随机整 合在植物细胞染色体上，采用含卡那霉素的培 养基筛选出植物细胞转化子。 该方法存在载体构建困难、效率低等不足。
射击植物
决定基因枪使用成功的因素
➢ 第一因素是动力系统
根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以 火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电 弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体 作为动力。
➢ 第二因素是微弹的制备过程 。用的微
载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直 径一般为0.6－4μm。 常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂 有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇 等。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
一、转基因植物
2、载体 载体：是目的基因的运输工具，它
能将分离克隆得到的目的基因导入 植物细胞并使其整合到寄主染色体 组中得以表达。
一、转基因植物
载体种类：
（1）目的基因克隆载体：目的基因克隆载 体与微生物基因工程类同，通常是由多拷 贝的E.coli小质粒为载体，其功能是保存 和克隆目的基因。 （2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大 肠杆菌质粒插入T－DNA片段及目的基因、 标记基因等构建而成。它是构建中间表达 载体的基础质粒。 （3）中间表达载体：中间表达载体是含有 植物特异启动子的中间载体，其功能是作 为构建转化载体的质粒。
载体介导法
将根癌农杆菌与植物原生质体、悬浮细胞、 叶盘、茎段共同培养，用根癌农杆菌含有目 的基因的质粒去转化植物受体。
将短暂共培养的受体洗去根癌农杆菌在含有 适量抗生素的培养基上培养，筛选具有抗生 素抗性标记的转化细胞，然后用特定培养基 诱导这些细胞形成转基因植株。
这种方法适合双子叶植物，大多数单子叶植物 因为不能诱导Ti质位vir区基因表达信号分子， 应用受到限制。
发现农杆菌是与根癌农杆菌同属的一种 病原土壤杆菌，含有Ri质粒，可以诱导植物 细胞产生毛状根，毛状根细胞能分化形成植 株。
由于Ri质粒也含有可高效整合到植物受 体细胞的染色体上并得到表达的T-DNA，因 此也可用作转基因植物的载体。
花粉管通道法
花粉管通道法又称子房注射法，是在植 物授粉后，将外源DNA注人子房的胎座 位置，使DNA沿着花粉管通道进入胚囊 与受精卵或者胚细胞接触而达到转化目 的。
❖根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴 性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形 成肿瘤,即诱发冠瘿瘤。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段 转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移 进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为 植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传 给子代 。
➢PEG是细胞融合剂，在磷酸钙、高pH条
件下引起原生质细胞膜表面电荷紊乱带 来通透性改变从而有助于细胞摄取外源 DNA。
化学物质诱导法
PEG法优缺点较稳定、重
复性好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合 转化体很少产生。 缺点
➢原生质体培养再生难度较大 ➢原生质体再生培养的转化植株变异率高,易
一、转基因植物
（4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的 Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化 载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：植物基因转化 载体是最后用于目的基因导入植物细胞的 载体，故亦称工程载体。它是由中间表达 载体和卸甲载体构建而成。根据它的结构 特点又可分为两种转化载体，即一元载体 系统和双元载体系统。
➢ 第三个因素是受体材料的选择
一、转基因植物
基因枪法优点： ①不受受体种类限制，特别适合根瘤农 杆菌不能浸染的植物 ②简化了质粒构建，可以用两个或两个 以上的质粒进行共转化，而不需构建一 个复杂的质粒 ③快速简便，转化率较高。
化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于
特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的 方法。常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚 乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇) 等,其中PEG法应用较多,效果较好。
病毒感染法
病毒可以感染植物组织，不受双子叶和 单子叶限制，作为植物转荃因载体的病 毒包括单链RNA病毒、 单链DNA病毒和 双链DNA病毒。
较为成熟的是花椰菜花斑病毒（CaMV） 和番茄金花叶病(TGMV )。
转基因植物鉴定
一般情况下，在受体细胞群中只有少部 分细胞获得了外源目的基因，而目的基 因被整合到受体细胞基因组并实现表达 的更少。因此必须从转化体系中筛选出 含有目的基因的重组体。 ➢常用方法包括:选择性培养检测、报告
Ti plasmid---circular ds DNA about 200kb
载体介导法
目前已经建立的Ti质粒介导方法有共整合转化、 二元整合转化等。 (一)Ti质粒介导的共整合转化系统
将外源基因整合到修饰过的T-DNA上形成可 穿梭的共整合载体，在vir基因产物作用下完成 目的基因向植物细胞的转移和整合。
液体MS浸泡15min
无生长素N6-AS共培养 3d
N6-H选择培养20d
抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d
优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程
1 2N6愈伤诱导 2 N6-BA预培养 3 N6-H选择培养
4 植 株 再 生
载体介导法
根癌农杆菌转化植物细胞的过程大致包 括： 1、农杆菌对植物细胞表面特定部位的识 别和附着 2、经敏感细胞的诱导作用，位于Ti质粒 上控制T区的基因转移的Vir区基因活化 并表达 3、T-DNA从Ti质粒上切割下来，通过细 菌和植物细胞的壁，转移并整合到植物 细胞的核基因组中。
基因枪法
基因枪法进行遗传转化的步骤： 1、靶细胞或组织的预处理：渗透压
调节（甘露醇、山梨醇） 2、质粒DNA的提取与纯化 3、微弹头的制备（质粒DNA浓度、
金粉颗粒处理） 4、轰击 （距离、压力） 5、抗性愈伤组织的诱导与筛选 6、植株再生与转化体筛选
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
共整合载体和农杆菌质粒重组过程
Ti质粒介导的共整合转化系统
（1）将删除tms、tmr和tmt基因的T-DNA片段克 隆到大肠杆菌载体质粒pBR322上（有氨苄青霉素 抗性标记) （2）然后分别插人新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基 因(卡那霉素抗性)和根癌农杆菌筛选标记，接入 外源基因，转化大肠杆菌，利用氨苄青霉素 （Apr）筛选阳性克隆。
载体介导法
（二)Ti质拉介导的二元整合转化系统 由两个分别含有T-DNA和vir区的Ti微型
质粒和辅助质粒构成，通过反式激活T-DNA转 移至植物细胞基因组内。
微型Ti质粒小，转移到农杆菌比较容易， 载体容易构建，效率较高。这是目前T-DNA转 化植物细胞比较常用的方法。
Ti质拉介导的二元整合转化系统
T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA， 故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因 与肿瘤的形成有关。
载体介导法
农杆菌转化的方法 1、共培养法：包括原生质体共培养、悬 浮细胞共培养核愈伤组织共培养。
农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略
表面有伤口的外植体
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
显微注射法和激光微束法等。 化学方法包括PEG法、脂质法等。
一、转基因植物
基因枪法最早是由 美国康奈尔大学 Sanford最先提出的。 1992年，世界首例 转基因小鼠就是通 过该法获得的。
一、转基因植物
基因枪法(gene gun bombardment)又称粒子轰
击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术 (high-velocity particle microprojection)， 经过加速装置用表面附着DNA分子(含目的基因） 的金属微粒轰击植物细胞，将DNA直接射入植物 细胞。
一、转基因植物
技术路线
目的基因分离 植物表达载体的构建 受体材料的准备
遗传转化
炼苗
转化组织 转化植株筛选 组织脱分化
一、转基因植物
1、受体 受体材料的选择 （1）叶盘:从幼嫩新鲜的植物叶片上用
打孔器取下直径约5mm的圆形叶片 （叶盘）作为外源DNA的转入受体。 （2）原生质体:无细胞壁易于接受外源 基因，同时细胞璧再生后可以再生完 整植株。
一、转基因植物
（3）悬浮细胞:单个细胞易于操作， 性状稳定。
（4）愈伤组织:属于分生细胞，易于 接受外源基因。
（5）胚状体:胚状体起源于单细胞， 嵌合现象不易发生。
一、转基因植物
（6）活体:在植株上形成新鲜伤 口，接种根癌农杆菌转化载体， 得到再生芽。
（7）胚轴、茎尖、茎段等也可以 作为转化受体。
Ti质粒介导的共整合转化系统
（3）将重组大肠杆菌与含野生型Ti质粒的根癌 农杆菌进行结合，通过同源重组，T-DNA质粒整 合到Ti质粒上得到重组根癌农杆菌，利用根癌 农杆菌筛选标记筛选。 （4）将得到的整合型根癌农杆菌感染植物愈伤 组织，携带大肠杆菌重组质粒的T-DNA便随机整 合在植物细胞染色体上，采用含卡那霉素的培 养基筛选出植物细胞转化子。 该方法存在载体构建困难、效率低等不足。
射击植物
决定基因枪使用成功的因素
➢ 第一因素是动力系统
根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以 火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电 弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体 作为动力。
➢ 第二因素是微弹的制备过程 。用的微
载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直 径一般为0.6－4μm。 常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂 有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇 等。