第十章 基因工程菌发酵
基因工程大肠杆菌发酵的研究ppt课件
• 要同时解决这两个问题是比较困难的，目前不少 基因工程研究研究室或生产厂对于这类菌的发酵 均遇到上述同类的问题，即菌体密度不高和表达 量低，他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵 体积，显然不是良策，因为含PL启动子的工程菌 在发酵过程中发酵体积越大（500～1000L），其 表达效率愈低，并大大增加了抽提分离表达产物 的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
• 三、基因工程菌 • 干扰素α-2b PL启动子氨苄青霉素抗性基因；降 钙素/JM103氨苄青霉素抗性基因；鱼生长激素 Trp启动子氨苄青霉素抗性基因.K8899/C600氨苄 青霉素抗性基因。
人干扰素α-2b
四、设备
• • 径高比：1:2~3； 装料系数: 70%； 罐体耐高温、耐酸碱、耐腐蚀的硅 硼玻璃罐与材质为进口316L的不 锈钢组合体；不锈钢内抛光精度 Ra≤0.8；特别设计的AQ保护装置， 无任怎样操作玻璃罐永不破碎； 搅拌系统：顶式机械搅拌，机械密 封。采用316L不锈钢专用搅拌轴 材料，精密加工，刚性好，长期使 用不变形； 灭菌：在位/离位灭菌；设置灭菌 程序，灭菌温度100-130℃； 接种：酒精火焰接种和插针接种； 控制系统：德国西门子PLC控制核 心+进口触摸屏；
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生产型发酵罐： 夹套：设计压力0.3 Mpa，夹套材质： 304不锈钢，用于温控、辅助灭菌；采 用优化导流设计，提高了交换效率和罐 内温度的均匀性； 进气过滤：采用一路深层通气质量流量 计显示，采用精度为0.2μm的进口除菌 过滤器，配空气分布器，防倒流装置； 确保安全并可独立灭菌，大大延长使用 寿命； 电机：采用德国汉森公司的调速电机 （加强型冷却装置，确保电机能在恶劣 的环境中长期运行）； 调 速 器：日本变频调速器 专用无菌取样阀：在位灭菌、微量取样 不染菌，无死角，不积料，使用方便； 专用无菌放料阀：在位灭菌、材质特制， 可无杂菌放料，无死角，不积料，使用 方便； 灭菌：蒸汽在位灭菌。设置灭菌程序， 灭菌温度100-130℃； 移种：316L不锈钢光亮管，隔膜阀。 在位灭菌； 控制系统： 德国西门子PLC控制核心+ 工业平板电脑；
基因工程菌发酵
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
DNA接头连接法
（三）目的基因导入受体细胞
（四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定
1、重组体的筛选 2、表达产物的鉴定
α 互 补 的 检 测
二、基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目
标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控原理：β-甘露聚糖酶能从底物LBG（Gum，Locus Bean洋槐豆粉）中水解产生还原糖，还原糖的产生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。
酶活力单位（U）的定义：在40℃.pH5.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mlLBG底物溶液生成1ug 还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），其中样品的酶活力以U/g（固体酶）或U/ml（液体酶）表示。
一、菌株及培养基1、菌株毕赤酵母基因工程菌株man。
2一级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
3、二级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
4、发酵罐培养基：2%葡萄糖，2.7%玉米浆干粉。
5、补料培养基：50%葡萄糖。
培养基灭菌：葡萄糖与其它培养基分开灭菌，玉米浆干粉121℃灭菌20min，葡萄糖121℃灭菌15min。
发酵过程调节pH：浓氨水二、仪器设备及试剂1、仪器设备电子天枰，高压灭菌锅，5L发酵罐，100L发酵罐，移液枪及枪头（100µL量程和1mL量程），1.5mLEP 管，小型离心机，水浴锅，电热炉，10mL比色管，立式摇床。
2、所需试剂及配制① 1/15 mol/L pH5.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液称取二水磷酸氢二钠11.876g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
称取磷酸二氢钾9.078g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
用以上两种溶液按适当比例混匀得pH5.0的PBS缓冲液。
②氢氧化钠溶液（200g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。
③ DNS试剂称取3.15 g 3,5- 二硝基水杨酸加到500mL单蒸水中，在40℃下水浴。
然后称20g氢氧化钠，溶于100mL 单蒸水中，缓慢将氢氧化钠溶液加到DNS溶液中，一边加入，一边搅拌，直至3,5- 二硝基水杨酸全部溶解。
基因工程菌发酵操作流程
基因工程菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。
8.种子罐培养基温度、PH(需进一步校准)、罐压、消泡达到发酵条件。
通知菌种室准备菌种转接。
9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。
10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。
11.大罐基础培养基领料及配制。
12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。
13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。
14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、补料管道、碱罐及碱管道上段的灭菌。
15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。
连接补料瓶调节至发酵条件。
16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。
17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。
18.补碱时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，控制流量。
19.补料罐补料培养基的领料定容配制。
20.补料罐补料培养基在位灭菌，同时对管道上段灭菌。
21.补料时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，设置流量。
22.诱导剂领料，在配料罐中加水配制定容。
23.将诱导剂打入种子罐，灭菌后保持罐压。
24.利用压力差将种子罐里的诱导剂移接到大罐。
25.一段时间后，大罐的PH、DO呈上升形态即为发酵结束，可放罐离心。
芽孢杆菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
第2讲 基因工程菌的发酵
二、基因工程菌发酵所用设备
基因工程菌的培养设备
（1）发酵罐的组成：发酵罐体、搅拌器、温控、灭
菌系统、空气无菌过滤系统、参数测量与控制系统、以 及培养液配制及连续操作装置等。
（2）基因工程菌对发酵设备的要求：
既要防止外部微生物侵入罐内，还要不使培养 物外漏。
机械搅拌式发酵罐
气升式发酵罐
三、基因工程菌的培养工艺
铵、硝酸铵、氯化铵等。 ③其他：无机盐、微量元素、维生素、生物素等，营养缺陷型菌 株还要补加相应的营养物质。
2 接种量的影响
① 什么是接种量?——移入的种子液体积和培养液体积之 比。 ② 接种量的大小对发酵有什么影响?
答：影响发酵的产量和发酵周期， （1）接种量小，菌体生长的延迟期长，不利于外源基因的表达； （2）接种量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，但
会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；
3
温度的影响
在复制水平上 在转录水平上 在其他方面
通过调控复制改变基因剂量来影响基因表达 通过影响RNA聚合酶作用来调控基因表达 在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
例如：大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄 糖阻碍，还受温度调控。
16℃和18℃培养时，菌体生长较慢，从而影响翻译，即酶的合 成。
4 溶解氧的影响
溶解氧（Dissolved oxygen,DO2）：是工程菌发酵培养过
程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和 产物生成的影响很大。
发酵前期，随DO2的下降，细胞生长减慢，ST (surface tension) 值下降； 发酵后期，随DO2的下降，ST值下降幅度更大，外源基因高水平转录和翻
基因工程菌发酵
基因工程菌发酵、表达与纯化
一、原理
基因工程菌是利用基因重组技术构建的生物工程菌，带外源基因的重组载体，通过生物工程菌的发酵获得大量的外源基因产物,并尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，所以需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵、表达和纯化工艺。
二、仪器
发酵罐、SDS-PAGE电泳仪
三、试剂
LB培养基（包括Yeast Extract、Polypeptone等）、琼脂、甘油
四、实验步骤
1. 在LB 培养基中加入细菌培养用琼脂(15 g/L ) 铺平皿, 用接种环划线接种甘油管基因工程菌菌种, 30℃培养过夜；
2. 挑取单菌落接种于含5 m l LB (含50ug/mL Amp ) 的试管中, 30℃、120 rpm摇菌培养到OD600 为0.2-0.8；
3. 取1 mL于另一试管中42℃培养3 小时, 离心收集菌体；
4. 以10%的接种量上发酵罐发酵培养；
5. 接种LB培养液诱导表达，采用SDS-PAGE电泳分析其表达量；
6. 据基因工程菌表达产物的不同采用不同的分离纯化方法，如盐析、层析、萃取等。
五、注意事项
在基因工程菌的发酵过程中，培养基的种类、pH值、培养的温度及接种量和发酵时间都会对其发酵效果及表达产物的分离纯化产生不同的影响，所以应多次试验进行全方面的优化。
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2、基因工程菌培养方式
基因工程菌发酵的基本操作方式有：
分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限
半连续培养（补料分批） 在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物
2、基因工程菌培养过程的动力学模型 目前的研究多分散于培养过程的各个方面。 （1）外源基因的表达和控制机制 （2）质粒的行为规律 （3）外界环境对工程菌生长及产物表达的综合影响
多采用二阶段培养 两种调节方式： •添加诱导物 •改变温度
（二）、基因工程菌发酵的设备
应用发酵罐来大规模培养基因工程菌。为了防止工程菌丢失携带的 质粒，保持基因工程菌的遗传特性，因而对发酵罐的要求十分严格。由于 生化工程学和计算机的发展，新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。
基因工程菌的培养设备
发酵罐的组成部分有：
发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器、 精细的温度控制和灭菌系统、 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等） 培养液配制及连续操作装置等。
基因工程菌的培养设备
基因工程菌在发酵培养过程中要求 环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。
► 优化细胞生长速率，使得碳源能被充分利用和 获得较高的产率，用养分流加来限制菌的生长 速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率。
► 可用碳源作为限制性养分，且采用补料分批发 酵来实现高密度发酵。
高密度发酵技术
► 用于高密度发酵的生物反应器类型： 搅拌罐，透析膜反应器， 气升式反应器，气旋式反应器
► 在工业化生产中，通常采用的是搅拌罐与补料工艺来 进行高细胞密度发酵。
毕氏酵 母
酿酒酵 母
特征
需氧、 葡萄糖 过量、 形成乙
醇 嗜温菌
嗜温菌
嗜温菌
基础培养 基
葡萄糖矿 物盐或甘 油矿物盐
含葡萄糖 的完全培
养基
葡萄糖矿 物盐
含葡萄糖 的完全培
养基
发酵 罐类 型
搅拌 罐
培养方法 细胞干 培养时 重（g/L） 间（h）
葡萄糖 （甘油） 非限制指 数补料
140～ 150
30～40
对发酵罐有特殊要求 如要提供菌体生长的最适条件 培养过程不得污染 保证纯菌培养 培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动
对发酵罐有特殊要求（续）
发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成 罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角 所有的连接接口均要用密封圈封闭，不得有泄漏 搅拌器转速和通气应适当 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料 培养液要经化学处理或热处理后才可排放 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
非结构模型
最理想的情况是 Ⅰ 把细胞群体处理
为一种溶质
非离散模型 均衡生长（假设）
结构模型
细胞之间无差异， 细胞内部有多个 Ⅲ 组分（结构）
“平均细胞”各种 Ⅱ 细胞不均一
均衡生长（假设） 离散模型
实际情况是细胞之
间不均一细胞内部
多个组分
Ⅳ
图：对细胞群体生长的发酵动力学模型描述
常规的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于， 微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要 目标。
基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是 相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不 需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的受体细 胞和高量的基因表达产物。
搅拌 补料分批 185 罐 培养，以
葡萄糖调 节pH
搅拌 补料分批 100 罐 培养，补
甲醇
搅拌 连续培养， 210 罐 流加葡萄
糖
30 50～120
80
产率 (g/L)/d 90～100
160
120～ 150
50～150
高密度发酵策略
► 使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设 计和计算生长得率。
一、基因工程菌发酵动力学 基因工程菌发酵控制的关键： •宿主的胜利遗传特性影响外源基因的表达 •外源基因的表达影响宿主的生长特性 （一）、基因工程菌的发酵动力学模型
基因工程培养体系是一个多相、多组分、非线性的 复杂系统。 1、基因工程菌的发酵动力学模型分类 对细胞群体的简化，假设有两个方面： •是否考虑细胞内部复杂的结构 •是否考虑细胞之间的差别
第十章 基因工程菌发酵
内容提要
•基因工程菌发酵动力学 •基因工程菌发酵设备 •基因工程菌的高密度发酵及控制 •基因工程菌发酵的后处理技术 •基因工程菌的不稳定性及对策 •基因工程生产干扰素
基因工程菌发酵的研究内容主要包括：
•基因工程菌的发酵动力学 •发酵工艺 •基因工程菌的稳定性 •基因工程菌发酵后处理 •产品的分离纯化
连续培养
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程 度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研 究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等 创造了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达水平或最大产率。
连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。 连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。
透析培养 固定化培养
补料分批培养
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间， 间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生 长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
（三）、基因工程菌的高密度发酵及控制 1、高密度发酵 •代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。 •高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到 广泛的重视。 •高密度发酵：在发酵过程中保持较高的细胞密 度，同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状 态。
高细胞密度发酵成功的实例
菌种
大肠杆 菌
枯草杆 菌