大肠杆菌基因工程菌常用类型
构建基因工程菌的宿主-载体系统
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所 有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转 录后修饰有些不同但它可提供最接近于天然副本的产物， 此外多数产物可以分泌到胞外。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水 平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的宿主是CHO （中国仓鼠卵巢细胞）。
人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其 他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作； 大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓 度（50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
基因工程菌养
大肠杆菌不是完美的宿主:
主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常 在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形 成不溶的包含体。
构建基因工程菌的宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，一般希 望翻译后的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是 否列入FDA表中，列入的认为是安全的菌。常用的宿主 系统有：
大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
基因工程菌培养
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用 的宿主。 优点：
主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产 物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定 性也比较差，所以在使用上有较大的限制，
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最 大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大的细菌大，容 易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白 的能力。这些是它的优点.但酵母达到高表达水平比大肠 杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其 他的酵母如甲醇营养型酵母等。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
细菌质粒性质：
5、质粒对于细菌的生长不是必须的
代表性细菌质粒（1）
F因子（fertility factor）
F因子，又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中 等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
★ 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型 （例如β 半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 ★ 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表 达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
缺点：
★ 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因 编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区 原核：CDNA 真核：DNA
划线到LB平板上。
质粒概述
质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子
不具有胞外期
对寄主细胞来说是非必需的 符合这三条标准的染色体外DNA或 RNA分子都可以称为质粒。 狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的 环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母p加2-3个 大写字母和数字，如pBV220，pET30 。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
郑丽舒
中国疾控中心 病毒病预防控制所
2015.04.15
主要内容
一、大肠杆菌：概述 应用 基本操作 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：λ噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆
大肠杆菌
大肠杆菌
中文名称： 外文名称： 大肠杆菌 Escherichia coli (Theodor Escherich 1885)
猪大肠杆菌病疫苗有哪些？猪大肠杆菌疫苗使用方法介绍
猪大肠杆菌病疫苗有哪些？猪大肠杆菌疫苗使用方法介绍畜牧堂倪老师为你,讲解该疾病的治疗预防:猪大肠杆菌病疫苗有哪些?目前，国内已商品化的猪大肠杆菌病疫苗有仔猪大肠杆菌病K88-K99双价基因工程活疫苗、仔猪水肿病多价油乳剂灭活疫苗、仔猪大肠杆菌病K88-K99双价基因工程灭活疫苗、仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗、仔猪大肠杆菌灭活苗。
猪场可用大肠杆菌K88ac-LTB双价基因工程菌苗，新生猪腹泻大肠杆菌K88、K99双价基因工程菌苗，子猪大肠杆菌腹泻K88、K99、987P三价灭活苗，MM-3工程菌苗(含K88ac及无毒肠毒素LT两种保护性抗原成分)等苗进行免疫接种。
猪大肠杆菌疫苗怎么使用?接种妊娠母猪，保护性抗体可通过初乳传递给哺乳仔猪，预防由产肠毒素大肠杆菌感染引起的仔猪黄痢。
猪大肠杆菌疫苗使用方法：耳根部皮下注射。
妊娠母猪在分娩前10-20天种1毫升。
目前，猪场主要使用K88、K99、987P三价菌苗来控制猪大肠杆菌病。
即可使用单苗，也可使有联苗，例如大肠杆菌病和产气荚膜梭菌病(红痢)联苗。
通常是初次妊娠的母猪分别在产前21天、14天每头注射l头份，之后只在产前14天进行1次免疫接种即可。
但在临床上来说，疫苗免疫效果有所不同，这主要是由于大肠杆菌具有各种血清型，抗原比较复杂，且变异性较强，从而导致购买的疫苗效果较差，无法很好的预防该病。
不过只要接种疫苗就具有一定的效果，尽管无法从根本上抑制该病，但及时配合使用药物进行控制就能够使病程明显缩短，减少死亡，且不容易出现复发。
根据本猪场的实际情况选择接种适宜的疫苗。
为预防猪水肿病，可在本猪场分离致病性菌株，并制成自家灭活菌苗，于仔猪断奶前1星期给每头肌肉注射2mL，能够促使仔猪得到较好的免疫效果。
猪大肠杆菌病能用药物预防吗?可以的。
母猪从产前1星期到产后1星期，可饲喂添加适量抗生素的饲料，并在产仔当天给其注射一针长效抗生素，用于控制母猪体内的细菌数量，不仅能够有效避免其发生乳房炎、子宫炎，同时还能够有效避免后代仔猪接触感染致病性大肠杆菌，另外还能够在一定程度上预防仔猪呼吸道疾病。
重要的模式生物——大肠杆菌
模式生物——大肠杆菌摘要：模式生物是生命科学研究的重要材料，目前公认的用于生命科学研究的常见模式生物有大肠杆菌、噬菌体、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥等.其中大肠杆菌对生命现象的揭密和探索等都所做出了重大贡献，对其在生命科学研究中的历史轨迹、各自优势、技术手段、热点研究、发展前景等系统而又简要的了解，有助于具体而又生动地体察到大肠杆菌在今天生命科学发展中的重要地位和推动生命科学不可替代的巨大潜力。
关键词：大肠杆菌模式生物生命科学一、大肠杆菌简介大肠杆菌(Escher i chia col i ) 是Escherich 在1885 年发现的, 在很长的时间里, 一直被认为是正常肠道菌落的组成部分, 认为是非致病菌。
直到20世纪中期,一些科学家才认识到一些含有血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性。
大肠杆菌作为研究生命科学中外源基因表达的宿主, 遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，所以大肠杆菌的大规模发酵经济, 倍受遗传工程专家的重视。
目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系, 常作为高效表达的首选体系。
20 世纪70 年代, 通过对大肠埃希菌的研究发现了操纵子学说并且绘制成了完整基因图谱, 基因组全序列完成, 全长为5 Mb, 共有4 288 个基因, 同时也搞清了所有基因的氨基酸序列。
62% 的基因功能已经阐明, 仍有38% 基因功能尚未完全搞清。
二、大肠杆菌在生命科学研究的各领域所做的贡献2.1 大肠杆菌用于基因突变研究突变型生物体在研究基因及蛋白质的性质的过程中扮演着重要角色。
通过一定的诱变剂如: HNO2、烷化剂等, 可使野生型大肠杆菌诱发突变, 从而产生突变型。
常见的大肠杆菌突变型大体有两种类型: ①合成代谢功能的突变型( anabolic functionalmutants)它是指在某些外界作用条件下, 基因组中部分基因发生突变时, 有些生化反应就不会正常进行, 因而使某些代谢失衡, 菌体也不会在基本培养基上存活, 这种突变多为条件致死突变。
大肠杆菌中的基因表达
PL 和 PR 表达系统
宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL
或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
cAMP
CAP lacI
RNRANA 聚聚合合酶酶
Plac
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（3）表达产物的稳定性： 组建融合蛋白； 利用信号肽； 特异性突变； 位点特异突变，改变二硫键位置； 宿主蛋白酶缺陷。
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（4）细胞的代谢负荷： 细胞大量生长时，抑制外源基因的表达； 宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开；
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和ATG的间距等。
A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的下游，可增加
基因的表达。lac、trp、 tac、bla。
B、核糖体结合位点的有效性 C、SD与ATG的间距：影响非融合蛋白的合成水平 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码
基因工程生产蛋白
基因⼯程⽣产蛋⽩基因⼯程法⽣产多肽和蛋⽩类药物基因⼯程法⽣产多肽和蛋⽩类药物，系指将合成多肽或蛋⽩的基因分离纯化后，结合上合适的表达载体转⼊它种⽣物并稳定遗传和表达的过程。
基因⼯程法⽣产多肽和蛋⽩类药物包括基因⼯程菌(细胞)构建、发酵(或细胞培养)、分离纯化、检验及制剂等环节，其中基因⼯程菌(细胞)构建⾄为关键。
基因⼯程菌(细胞)常⽤的宿主菌(细胞)包括微⽣物和真核⽣物细胞，最常⽤的有⼤肠杆菌、酵母菌和中国仓⿏卵巢细胞，其中尤以⼤肠杆菌和酵母菌最为普遍，是本章介绍的重点。
⼀、⽣产⽤微⽣物的来源及发酵特性⽣产⽤微⽣物主要来源于两个⽅⾯，⼀是从⾃然界分离，⼆是⼈⼯改良。
从⾃然界分离到的微⽣物由于受⾃⾝代谢调节的控制，蛋⽩类药物的合成量⼗分低。
另外，⾃然界中的微⽣物合成的蛋⽩质药物各类也⼗分有限。
为了提⾼蛋⽩类药物的产量，丰富其种类，对⾃然界分离的微⽣物进⾏改良成为必然。
改良⽅法主要有⼈⼯诱变法和基因⼯程法，其中尤以基因⼯程⽅法⽤得最为普遍。
基因⼯程⽅法改良微⽣物，就是通过把某⼀特定的外源基因，通过⼀定的载体，放⼊宿主细胞内，使之随宿主细胞的⽣长和繁殖⼀起复制和表达。
外源基因的表达产物属于异已物质，并可能对宿主细胞有毒性。
⼤量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的⽣长平衡，如⼤量的氨基酸被⽤于合成与宿主细胞⽆关的蛋⽩质，从⽽影响其他代谢过程。
有的表达产物本⾝对细胞有害，表达产物的⼤量积累可能导致细胞⽣长缓慢甚⾄死亡。
由于基因⼯程产物在细胞内过量合成，必然会影响宿主的⽣长和代谢，⽽细胞⽣长受限，⼜反过来抑制了外源基因产物的合成。
所以必须合理调节这种消长关系，使宿主细胞的代谢负荷不⾄于过重，⼜能⾼效表达外源基因。
为了减轻宿主细胞的代谢负荷，提⾼外源基因的表达⽔平，可以采取当宿主细胞⼤量⽣长时，抑制外源基因表达的措施。
即将细胞的⽣长和外源基因的表达分成两个阶段，使表达产物不会影响细胞的正常⽣长，当宿主细胞的⽣物量达到饱和时，再进⾏基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷。
8基因表达,大肠杆菌基因工程
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’
，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：以AUG；GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列。
C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱
去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，工 艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
人胰岛素的生产方法
利用基因工程菌发酵生产人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素， 成为世界上第一个上市的基因工程药物；1987年，Novo公司又推出
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： 化学合成A链 和B链的编码
Apr
tac
Met b-Gal Met A peptide Apr
tac
Met b-Gal Met B peptide
序列
ori
ori
M
M
M
M
N
C
N
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
b-Gal
外源基因在原核细胞中的表达
现将真核基因在原核细胞中表达： 1、外源基因克隆在表达载体并导人宿主菌。
2、外源基因不能有间隔序列(内含子)，因而必须用cDNA或全
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是指经过基因工程技术改造的微生物菌株，广泛应用于生物工程、医学和农业等领域。
本文将介绍一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程。
一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括以下几个步骤：1. 选择宿主菌株：根据所需的功能和目标，选择合适的菌株作为宿主，常见的宿主菌株有大肠杆菌、酵母菌等。
2. 提取目标基因：从源菌株中提取所需的目标基因，可以通过PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法获取目标基因片段。
3. 载体构建：将目标基因片段与合适的载体进行连接，构建重组载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4. 转化：将重组载体导入宿主菌株中，使目标基因能够稳定表达。
5. 筛选和鉴定：经过转化的菌株进行筛选和鉴定，常用的方法有抗性筛选和PCR鉴定等。
6. 培养和扩大：经过筛选和鉴定的基因工程菌株进行培养和扩大，得到足够的菌体。
二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物工程、医学和农业等领域有广泛的应用。
下面以生物工程领域为例，介绍基因工程菌的应用与流程。
1. 目标基因的克隆与表达从源菌株中提取目标基因，并通过PCR扩增获取目标基因片段。
然后将目标基因片段与适当的载体连接，构建重组载体。
接下来，将重组载体导入宿主菌株中，经过筛选和鉴定，获得含有目标基因的基因工程菌株。
最后，通过培养和表达优化等步骤，使目标基因在基因工程菌中稳定表达，并获得足够的目标蛋白产物。
2. 代谢工程与合成生物学基因工程菌在代谢工程和合成生物学中起到重要作用。
通过基因工程技术，可以改造菌株的代谢途径，使其具有特定的代谢功能。
例如，通过引入外源基因，可以使菌株具备合成特定化合物的能力，如生物染料、药物等。
通过调控代谢途径中的关键基因表达水平，还可以实现代谢产物的高效合成。
3. 蛋白质工程与酶工程基因工程菌在蛋白质工程和酶工程中也有广泛应用。
通过基因工程技术，可以改变蛋白质的结构和功能，实现蛋白质的改良和优化。
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1、大肠杆菌DH5a菌株
DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1
2、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株
该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）
3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株
该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr
4、大肠杆菌JM109菌株
该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]
5、大肠杆菌TOP10菌株
该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG
6、大肠杆菌HB101菌株
该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。
基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1
7.XL10-Gold菌株：所制备的感受态细胞是目前转化效率最高的感受态细胞，缺失几乎所有已知的限制酶切系统；同时缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性，提高感受态转化效率及大质粒转化能力的宿主菌基因型。