大肠杆菌基因工程(2)
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
高中生物4章基因工程2节基因工程的操作程序2课时目的基因的导入和检测
第2课时目的基因的导入和检测[目标导读] 1.结合教材P77～81图文，阐明目的基因的导入的四种方法。
2.分析教材P81～83内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。
[重难点击] 1.目的基因的导入方法。
2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、目的基因的导入1．花粉管通道法(如图)(1)概念：是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。
常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。
(2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序①原理：授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。
②操作过程a．提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01%的溶液。
b．用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。
c．第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。
基因工程-外源基因在大肠杆菌中的表达2
基因工程5 2 3 4 16789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化6.3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略6 外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建细胞定位包涵体型异源蛋白的表达重组异源蛋白的细胞定位胞质型、周质型（内膜与外膜之间的空隙）和胞外型将重组异源蛋白引导至何种特定的细胞间隔各有利弊。
优选胞质，原因是在胞质型表达的表达水平高。
包涵体型异源蛋白的表达（胞质型）分泌型异源蛋白的表达（周质型或胞外型）融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建单独表达融合表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies ，IB ）。
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。
除此之外，包涵体中还含有少量的DNA 、RNA 和脂多糖等非蛋白分子。
包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点高效表达重组异源蛋白包涵体表达形式的优点：以包涵体形式表达的重组异源蛋白可达细菌蛋白总量的20%-60%。
具有固相特性，从而简化外源基因表达产物的分离纯化包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成份，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。
基因工程2
方法 DNA分子杂交法
分子 水平
目的基因是否转录 DNA-RNA分子杂交法 目的基因是否翻译
抗原－抗体杂交法 接种实验
个体 ห้องสมุดไป่ตู้平
受体是否具有 转基因特征
步骤五：实现功能表达
DNA分子杂交
步骤五：实现功能表达
基因探针，是一段带有检测标记，且序
列已知的，与目的基因互补的核酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合， 产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的 基因显示出来。
步骤一：获取目的基因
基因工程的目的基因－－ 从供体转移到受体的基因。
与生物抗逆性相关的基因 与优良品质相关的基因 与生物药物和保健品相关的基因 与毒物降解相关的基因
与工业所需酶相关的基因
具有调控作用的因子 ……
步骤一：获取目的基因 • 目的基因的提取方法
直接分离基因 ：鸟枪法（散弹射击法）
步骤三：转化受体细胞 • 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
步骤三：转化受体细胞
植物细胞
受体 细胞
动物细胞 原核细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
显微注射技术
感受态法
步骤三：转化受体细胞
步骤一：获取目的基因 • 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1）DNA合成仪： 对比较小，核苷酸序 列已知的基因用化学方 法直接人工合成。 2）PCR技术： 使目的基因的片段 在短时间内成百万倍 地扩增。
PCR扩增仪
DNA合成仪
步骤一：获取目的基因基因 • 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点 缺点 工作量大，盲目，分 离出来的有时并非一 个基因 操作过程麻烦，mRNA 很不稳定，要求的技 术条件较高 操作简便 广泛使用 专一性强
第二章基因工程习题答案
基因工程课程习题选择题001 基因工程操作的三大基本元件是【Ａ】I 供体II 受体III 载体IV 抗体V 配体ＡI + II + IIIＢI + III + IVＣII + III + IVＤII + IV + VＥIII + IV + V002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【E】I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率Ａ I + II + IIIＢ I + II + IVＣ I + III + IVＤ II + III + IVＥ I + II + III + IV003 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【A】Ａ基因诱变Ｂ分子克隆Ｃ DNA重组Ｄ遗传工程Ｅ基因无性繁殖004 基因工程的单元操作顺序是【B】Ａ增，转，检，切，接Ｂ切，接，转，增，检Ｃ接，转，增，检，切Ｄ检，切，接，增，转Ｅ切，接，增，转，检005 下列有关基因的叙述，错误的是【A】Ａ蛋白质是基因表达的唯一产物Ｂ基因是 DNA 链上具有编码功能的片段Ｃ基因也可以是 RNAＤ基因突变不一定导致其表达产物改变结构Ｅ基因具有方向性006 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是【D】Ａ修复自身的遗传缺陷Ｂ促进自身的基因重组Ｃ强化自身的核酸代谢Ｄ提高自身的防御能力Ｅ补充自身的核苷酸消耗007 天然 PstI 限制性内切酶的来源是【D】ＡBacillus amyloliquefaciensＢEscherichia coliＣHaemophilus influenzaeＤProvidencia stuartiiＥStreptomyces lividans008 T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【D】Ａ 2' -OH 和 5' -PＢ 2' -OH 和 3' -PＣ 3' -OH 和 2' -PＤ 3' -OH 和 5' -PＥ 5' -OH 和 3' -P009若载体 DNA 用 M 酶切开，则下列五种带有 N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中，能直接与载体拼接的是【D】M NＡ A/AGCTT T/TCGAAＢ C/CATGG ACATG/TＣ CCC/GGG G/GGCCCＤ G/GATCC A/GATCTＥ GAGCT/C G/AGCTC010下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是【B】Ａ质粒是共价环状的双链 DNA 分子Ｂ天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列Ｃ质粒在宿主细胞内能独立于染色体 DNA 自主复制Ｄ松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增Ｅ质粒并非其宿主细胞生长所必需011带有多个不同种复制起始区的质粒是【A】Ａ穿梭质粒Ｂ表达质粒Ｃ探针质粒Ｄ整合质粒Ｅ多拷贝质粒012 下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【A】Ａ Cosmid > λ-DNA > PlasmidＢλ-DNA > Cosmid > PlasmidＣ Plasmid >λ-DNA > CosmidＤ Cosmid > Plasmid >λ-DNAＥλ-DNA > Plasmid > Cosmid013 目前在高等动物基因工程中广泛使用的载体是【C】Ａ质粒 DNAＢ噬菌体 DNAＣ病毒 DNAＤ线粒体 DNAＥ叶绿体 DNA014 若某质粒带有lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【D】Ａ半乳糖Ｂ葡萄糖Ｃ蔗糖Ｄ5- 溴-4- 氯-3- 吲哚基- b -D- 半乳糖苷（X-gal ）Ｅ异丙基巯基- b - 半乳糖苷（IPTG ）015质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是【C】①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA ⑥环状DNA⑦能“友好”地“借居”A ①③⑤⑦B ②④⑥C ①③⑥⑦D ②③⑥⑦016 双脱氧末端终止法测定DNA 序列是基于【A】ＡDNA 的聚合反应ＢDNA 的连接反应ＣDNA 的降解反应Ｄ特殊的DNA 连接酶Ｅ聚合单体2' 和5' 位的脱氧017 下列三种方法中，能有效区分重组子与非重组子的是【E】I 限制性酶切II PCR 扩增III 抗药性筛选ＡIＢI + IIＣI + IIIＤII + IIIＥI + II + III018鸟枪法克隆目的基因的战略适用于【A】Ａ原核细菌Ｂ酵母菌Ｃ丝状真菌Ｄ植物Ｅ人类019 cDNA 第一链合成所需的引物是【D】ＡPoly AＢPoly CＣPoly GＤPoly TＥ发夹结构020 Taq DNA 聚合酶的发现使得PCR 技术的广泛运用成为可能，这是因为【D】ＡTaq DNA 聚合酶能有效地变性基因扩增产物ＢTaq DNA 聚合酶催化的聚和反应不需要引物ＣTaq DNA 聚合酶具有极强的聚和活性ＤTaq DNA 聚合酶能使多轮扩增反应连续化ＥTaq DNA 聚合酶能使扩增反应在DNA 变性条件下进行021 为了利用PCR 技术扩增下列染色体DNA 片段上的虚线部分，应选用的引物顺序是【D】ＡI + IIＢI + IIIＣI + IVＤII + IIIＥII + IV022 构建基因文库一般使用的载体是【E】I 质粒IIλ-DNA III CosmidＡIＢIIＣIIIＤII + IIIＥI + II + III023 强化基因转录的元件是【C】Ａ密码子Ｂ复制子Ｃ启动子Ｄ内含子Ｅ外显子024 启动子的特征之一是【B】ＡGC 富积区ＢTATA BoxＣ转录起始位点Ｄ长度平均1 kbＥ含有某些稀有碱基025 下列基因调控元件中属于反式调控元件的是【A】Ａ阻遏蛋白Ｂ启动子Ｃ操作子Ｄ终止子Ｅ增强子026包涵体是一种【E】Ａ受体细胞中难溶于水的蛋白颗粒Ｂ大肠杆菌的亚细胞结构Ｃ噬菌体或病毒DNA 的体外包装颗粒Ｄ用于转化动物细胞的脂质体Ｅ外源基因表达产物的混合物027 外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是【Ｅ】I 融合基因能稳定扩增II 融合蛋白能抗蛋白酶的降解III 表达产物易于亲和层析分离ＡIIIＢI + IIＣI + IIIＤII + IIIＥI + II + III028 第二代基因工程是指【C】Ａ途径工程Ｂ代谢工程Ｃ蛋白质工程ＤRNA 基因工程Ｅ细胞器基因工程029 基因工程菌中重组质粒的丢失机制是【Ｃ】Ａ重组质粒渗透至细胞外Ｂ重组质粒被细胞内核酸酶降解Ｃ重组质粒在细胞分裂时不均匀分配Ｄ重组质粒杀死受体细胞Ｅ重组质粒刺激受体细胞提高其通透性030利用毛细管作用原理，将凝胶电泳分离后的DNA片段转移至硝酸纤维素膜上并根据核酸杂交原理进行分析的技术是【Ｄ】ＡWestern 印迹转移技术ＢNorthern 印迹转移技术Ｃ基因的表现型分析法ＤSouthern 印迹转移技术031在翻译过程中．mRNA必需首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。
生物：基因工程及其应用(极品课件)2
当人类拥有了只有大自然才拥有的改造生 创造生物的能力时,我们是否感到很坦然呢? 物,创造生物的能力时,我们是否感到很坦然呢?
转基因食品
安全吗?! 安全吗
目前,大多数专家认为, 目前,大多数专家认为,已经投入 商品化生产的转基因番茄, 商品化生产的转基因番茄,玉米等 农产品都是安全的. 农产品都是安全的.迄今为止尚无 食用转基因生物产品引起任何严重 问题的科学报道. 问题的科学报道.
基因工程在畜牧养殖业上的应用 繁殖具有抗病能力 抗病能力, 1,繁殖具有抗病能力, 高产仔率, 高产仔率,高产奶率和 高质量的皮毛等优良品 高质量的皮毛等优良品 转基因动物. 质的转基因动物 质的转基因动物.
超级羊
将人的生长激素基因和牛的生长激素 基因分别注射到小白鼠受精卵中, 基因分别注射到小白鼠受精卵中,得到 的"小超级鼠".
胰岛素——治疗糖尿病的特效药 胰岛素——治疗糖尿病的特效药. 治疗糖尿病的特效药. 干扰素——抗病毒的特效药 干扰素——抗病毒的特效药. 抗病毒的特效药.
基因工程药品
白细胞介素,溶血栓剂, 白细胞介素,溶血栓剂,凝 血因子, 血因子,人造血液代用品
人造血液及其生产 人造血液及其生产
我国生产的部分基因 工程疫苗和药物 疫苗: 疫苗: 乙肝,狂犬病,百日 乙肝,狂犬病, 霍乱,伤寒, 咳,霍乱,伤寒,疟 疾
标记 基因
二,基因工程的应用
基因工程在农业上的应用: 基因工程在农业上的应用: 1)高产,稳产和具优良品质的品种 高产,稳产和具优良品质的品种 和具优良品质
用基因工程的方法可以改 善粮食作物的蛋白质含量. 善粮食作物的蛋白质含量. 向日葵豆"植株. 如"向日葵豆"植株.
基因工程试卷及答案 (2)
基因工程试卷及答案一、名词解释题1.同尾酶：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可以产生相同的黏性突出末端。
这些酶统称为同尾酶。
p222.星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。
p263.基因克隆：通过体外重组技术，将一段目的DNA经切割、连接、插入适当载体，并导入受体细胞扩大形成大量子代分子的过程。
p394.基因文库：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。
p395.包涵体蛋白：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起所形成的没有生物活性的、无膜裸露结构。
6.反义核酸：是指一些可以通过碱基互补原则与被感染细胞内部的某个靶标mRNA或DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割mRNA使其丧失功能的人工合成的单链反义分子。
p3467.反义DNA:：称反义寡核苷酸，是一种人工合成的、能与mRNA互补的、用于抑制翻译的短小反义核酸分子。
p3478.RNA干扰（RNAi）：是指对应与某种mRNA的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）分子使mRNA发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉默现象。
p3509.限制性内切酶：是一种能识别双链DNA中的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核苷酸酶。
p1510.基因治疗：是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织，通过替换或补偿引起疾病的基因，或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。
二、选择题1、DNA分子SexAI每隔多少个碱基会出现一个酶切位点（D ）A、256B、1024C、4096D、163842、下列序列中认为哪一个最有可能是二类限制酶切位点（C ）A、GAATCGB、GCTATGC、AAATTTD、AGGGGCA3、下列当A260/A280=（A ）时，为纯DNA的是。
第十四章：大肠杆菌基因工程资料
突变碱基对，其活性比野生型Plac启动子更强，而 且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但 仍为受体细胞中的Lac阻遏蛋白阻遏，因此可以用
乳糖或IPTG进行有效诱导。人工构建的Ptac启动子
由于含有lac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与
PlacUV5相同。
cI857 控制 PλL ， cI857 阻遏蛋白在 42℃时失
活脱落， PL 便可介导目的基因的表达，但
在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常
使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控
制目的基因表达。
当培养基中缺少色氨酸时，Ptrp启动子打开，CI 阻遏蛋白合成，由Pl启动子介导的外源基因转录 关闭；相反，当色氨酸大量存在时，Ptrp启动子 关闭，CI阻遏蛋白不再合成，Pl启动子开放并激 活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然 处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温 度进行诱导表达。
第十四章
大肠杆菌基因工程
第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征
一．大肠杆菌表达外源基因的优势 1.全基因组测序，遗传背景清楚 ， 共有4405个开放阅读框架。 2.基因克隆表达系统成熟完善。
3.繁殖迅速，培养简单，操作方便， 遗传稳定。 4.被美国FDA批准为安全的基因工程 受体生物。
5.成本低
二．大肠杆菌表达外源基因的劣势 1.缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。 2.内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白。 3.不具备真核生物的蛋白质复性系统。 4.其细胞膜间隙含有大量的内毒素，
构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针
质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。
③滤膜结合法分离
原理是双链 DNA 不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而 DNA-
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7-1. 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的 大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧 失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同 源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细 菌细胞内。
除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋 白分子。
形成二硫键的方式主要有：
➢ 化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空 气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸 残基的蛋白质的重折叠。
HS A S
HS
S
2e + 2H+
➢ 二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和
GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠
A
AA
蛋白质不能进入复性过程，因此，成为无活性的蛋白质。
❖包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进
行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）和复性操作。2）包涵体的溶 Nhomakorabea与变性：
包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。
能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：
4. 包涵体的变性与复性操作
1）蛋白质变性复性的动力学原理： C1
C2
Cn C
U 变性状态的蛋白质 N 天然状态的蛋白质
U
I1
In N
C 共价修饰的蛋白质 A 集聚状态的蛋白质
I 有效变复性过程中的中间状态
X1 X2 Xn X
X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态
❖在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的 A
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发
形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应
极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强
5. 包涵体的复性与重折叠（refolding）：
二、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
（一）包涵体型异源蛋白的表达
1. 包涵体及其性质
包涵体(Inclusion Bodies，IB)：在某些生长条件下， 大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地 集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶 性结构。
1. 蛋白质的分泌机制
原核细菌周质中含有多 种分子伴侣可阻止分泌蛋 白的随机折叠，分泌在细 胞周质或培养基中的重组 蛋白很少形成分子间的二 硫键交联；
因此与包涵体相比，分 泌型重组蛋白具有较高比 例的正确构象，生物活性 的回收率增加，且对蛋白 酶不敏感。
效果好。
HS
HS
B S-S-R
+ R-S-S-R
HS
S
S
2R-SH
（二）分泌型异源蛋白的表达
在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分 为两种形式：
➢即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中； ➢或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外
膜进入培养基中。
蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。
能简化外源基因表达产物的分离操作
包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分， 菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋 白从细菌裂解物中分离出来。
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异 源重组蛋白的稳定性已不再构成威胁。
包涵体表达形式的缺点：
生物工程专业核心课程
基因工程
7. 基因工程的应用
大肠杆菌基因工程 酵母菌基因工程 高等植物基因工程 哺乳动物基因工程
细菌与基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次 完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基 因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。
几年后，第一个基因工程产品—利用构建基因的基因工 程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的 产业时代。
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
2. 以包涵体形式表达目的蛋白的操作
如果未进行特殊设计(如分泌型表达或融合型表达),外 源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以 上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。
因此，以包涵体形式表达目的基因的操作关键就是选择 高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长 处所在。
3. 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的优点：
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必 须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构 象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操 作的效率对目标产物的收率至关重要。
然而，这也是一个技术难题,尤其当目标蛋白分子中的Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不 超过30%。
包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新形成二硫键， 多肽链重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性
包涵体的复性与重折叠(refolding)：二硫键形成
在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽 链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重 的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须 重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。