大肠杆菌基因工程
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程大肠杆菌生产胰岛素的流程
基因工程大肠杆菌生产胰岛素的流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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第三章大肠杆菌基因工程-1
Plac -lacI 调控模式的问题与策略
问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活蛋白（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
目的基因
cI857 PL B
吲哚丙烯酸，IAA）。
T7启动子 ——来自T7噬菌体的异源启动子
T7启动子——最成功的启动子
*只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合
酶的快 5 倍
*由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。
P
O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子的筛选
采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
8基因表达,大肠杆菌基因工程
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’
，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：以AUG；GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列。
C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱
去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，工 艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
人胰岛素的生产方法
利用基因工程菌发酵生产人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素， 成为世界上第一个上市的基因工程药物；1987年，Novo公司又推出
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： 化学合成A链 和B链的编码
Apr
tac
Met b-Gal Met A peptide Apr
tac
Met b-Gal Met B peptide
序列
ori
ori
M
M
M
M
N
C
N
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
b-Gal
外源基因在原核细胞中的表达
现将真核基因在原核细胞中表达： 1、外源基因克隆在表达载体并导人宿主菌。
2、外源基因不能有间隔序列(内含子)，因而必须用cDNA或全
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
参考内容
引言
人胰岛素是一种重要的生物药物，对于治疗糖尿病具有显著效果。传统上，人 胰岛素的生产主要通过从人身体中提取胰岛素原，然后进行化学合成和结构改 造。然而，这种方法不仅成本高昂，而且生产周期长，难以满足市场需求。近 年来，随着生物技术的发展，利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法逐渐得到 广泛应用。本次演示将详细介绍利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法和相关 技术。
展望未来，基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究有望为糖尿病治疗 提供更加安全、有效的药物。随着科学技术的不断进步和研究的深入，我们相 信未来能够在提高产量、降低成本、优化质量等方面取得更大的突破。加强与 其他领域（如纳米技术、生物信息学等）的跨学科合作，将为该领域的研究和 应用提供更为广阔的前景。
生产流程
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的生产流程包括以下几个步骤：
1、细胞悬浮：将大肠杆菌接种到发酵罐中的无菌培养基中，在适宜的温度和 湿度条件下进行培养。培养过程中需监测细菌生长情况，以确保细菌处于最佳 生长状态。
2、发酵：当细菌生长到一定密度时，向发酵罐中加入适量的诱导剂，以诱导 细菌表达人胰岛素基因。发酵过程中需控制温度、湿度、氧气浓度等参数，以 确保细菌正常表达胰岛素基因。
一、背景介绍
基因工程技术是一种利用微生物或细胞体系生产人类所需蛋白质的技术。在过 去几十年中，基因工程技术得到了广泛应用，并在制药、生物能源、环境保护 等领域发挥了重要作用。重组人胰岛素是一种利用基因工程技术生产的胰岛素， 它与人体产生的胰岛素具有相似的结构和功能。然而，重组人胰岛素的生产过 程比较复杂，需要经过多个步骤，因此生产成本较高。
3、收集：发酵结束后，收集细菌培养液并进行过滤，以去除其中的杂质和细 胞残骸。
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（1）核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’， 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将 mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
（1）启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
启动子
目的基因
E
E
A 酶切开 Bal31酶解
解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的 轨道
(2)质粒扩增时序的控制
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60
PL MCS
在42℃时，拷贝数迅速增至300 - 600
在此温度下，受体细胞染色体上的CI基
pCP3
因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 Apr
（2）以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的优点：
能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体 经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂 解物中分离出来
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组 蛋白的稳定性已构不成威胁
培养罐中迅速升温非常困难，因
Ptrp
此常使用一个双质粒控制系统，
用色氨酸间接控制目的基因表达
阻遏作用
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达 B
终止子
（1）强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；
细胞内tRNA的含量
(2)密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程 大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略 可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：
（2）强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的
rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对
于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用
终止子也可以象启动子那样，通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选
第2章 大肠杆菌基因工程
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略 四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 五、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
Plac 葡萄糖代谢
O cAMP浓度降低
基底水平转录
Plac
O
高效转录
Plac UV5 O
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸 阻遏蛋白
基底水平转录
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达
ori
因此，用一种手段同时控制质粒拷
贝数和基因的表达
三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体型异源蛋白的表达
（1）包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它 们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不 溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和 脂多糖等非蛋白分子
（2）核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低
SD序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
（4）启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
基底水平转录 阻遏蛋白
O 诱导
高效转录 O
乳糖启动子Plac的可控性：
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
质粒拷贝数
(1)质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增 殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进 而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降
含有外源启动子活性的重组克隆
（3）启动子的构建
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
-10 区序列
GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
Ptrp 除去色氨酸
Ptrp
Ptrp
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
Otrp 高效转录
Otrp
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因
Ptrp
工程中常使用温度敏感型的cI突
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
（2）启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质 粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
Apr ori
pKO1
终止密码子 galK
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
包涵体表达形式的缺点：
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通 过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具 有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产 物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白 分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不超过30%