大肠杆菌基因工程
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大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程大肠杆菌生产胰岛素的流程
基因工程大肠杆菌生产胰岛素的流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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第三章大肠杆菌基因工程-1
Plac -lacI 调控模式的问题与策略
问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）
突变型乳糖启动子Plac UV5
CAP正调控
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活蛋白（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
目的基因
cI857 PL B
吲哚丙烯酸，IAA）。
T7启动子 ——来自T7噬菌体的异源启动子
T7启动子——最成功的启动子
*只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合
酶的快 5 倍
*由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。
P
O
乳糖启动子Plac
转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子的筛选
采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Apr pKO1 galK
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
第十四章：大肠杆菌基因工程
①启动子本身的序列，尤其是-10区 和-35区的碱基组成及彼此间的距 离
②启动子与外源基因转录起始位点 之间的距离
2.启动子最佳作用距离的探测
其中目的基因表达量最高的克隆即具有最 佳的启动子作用距离。
若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有 必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。
3.启动子的筛选 ①鸟枪法克隆 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针质粒pKO1上， 受 体 细 胞 染 色 体 DNA 上 的 galE 、 galT 与质粒报告基因galK的表达产物联合 作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解 成红色素物质。
②色氨酸启动子Ptrp的可控性
Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏， 转录呈基底状态，在培养系统中去除色 氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有 效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨 酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp 介导的目的基因的表达。
③λ噬菌体启动子PλL的可控性
PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因 工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型 的 cI 突 变 基 因
活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然
处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温
度进行诱导表达。
二．终止子
外源基因在强启动子的控制下表达， 易发生转录过头现象，即RNA聚合酶 滑过终止子结构继续转录质粒上邻 近的DNA序列，形成长短不一的mRNA 混合物。
1.过长转录物的产生在很大程度上会 影响外源基因的表达，原因如下：
③滤膜结合法分离
原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测 DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温 和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后 再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说， 这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性 （即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通 常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。
②启动子与外源基因转录起始位点 之间的距离
2.启动子最佳作用距离的探测
其中目的基因表达量最高的克隆即具有最 佳的启动子作用距离。
若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有 必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。
3.启动子的筛选 ①鸟枪法克隆 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针质粒pKO1上， 受 体 细 胞 染 色 体 DNA 上 的 galE 、 galT 与质粒报告基因galK的表达产物联合 作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解 成红色素物质。
②色氨酸启动子Ptrp的可控性
Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏， 转录呈基底状态，在培养系统中去除色 氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有 效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨 酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp 介导的目的基因的表达。
③λ噬菌体启动子PλL的可控性
PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因 工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型 的 cI 突 变 基 因
活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然
处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温
度进行诱导表达。
二．终止子
外源基因在强启动子的控制下表达， 易发生转录过头现象，即RNA聚合酶 滑过终止子结构继续转录质粒上邻 近的DNA序列，形成长短不一的mRNA 混合物。
1.过长转录物的产生在很大程度上会 影响外源基因的表达，原因如下：
③滤膜结合法分离
原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测 DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温 和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后 再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说， 这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性 （即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通 常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。
8基因表达,大肠杆菌基因工程
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’
，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：以AUG；GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列。
C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱
去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，工 艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
人胰岛素的生产方法
利用基因工程菌发酵生产人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素， 成为世界上第一个上市的基因工程药物；1987年，Novo公司又推出
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： 化学合成A链 和B链的编码
Apr
tac
Met b-Gal Met A peptide Apr
tac
Met b-Gal Met B peptide
序列
ori
ori
M
M
M
M
N
C
N
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
b-Gal
外源基因在原核细胞中的表达
现将真核基因在原核细胞中表达： 1、外源基因克隆在表达载体并导人宿主菌。
2、外源基因不能有间隔序列(内含子)，因而必须用cDNA或全
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
参考内容
引言
人胰岛素是一种重要的生物药物，对于治疗糖尿病具有显著效果。传统上，人 胰岛素的生产主要通过从人身体中提取胰岛素原，然后进行化学合成和结构改 造。然而，这种方法不仅成本高昂，而且生产周期长，难以满足市场需求。近 年来，随着生物技术的发展，利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法逐渐得到 广泛应用。本次演示将详细介绍利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法和相关 技术。
展望未来，基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究有望为糖尿病治疗 提供更加安全、有效的药物。随着科学技术的不断进步和研究的深入，我们相 信未来能够在提高产量、降低成本、优化质量等方面取得更大的突破。加强与 其他领域（如纳米技术、生物信息学等）的跨学科合作，将为该领域的研究和 应用提供更为广阔的前景。
生产流程
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的生产流程包括以下几个步骤：
1、细胞悬浮：将大肠杆菌接种到发酵罐中的无菌培养基中，在适宜的温度和 湿度条件下进行培养。培养过程中需监测细菌生长情况，以确保细菌处于最佳 生长状态。
2、发酵：当细菌生长到一定密度时，向发酵罐中加入适量的诱导剂，以诱导 细菌表达人胰岛素基因。发酵过程中需控制温度、湿度、氧气浓度等参数，以 确保细菌正常表达胰岛素基因。
一、背景介绍
基因工程技术是一种利用微生物或细胞体系生产人类所需蛋白质的技术。在过 去几十年中，基因工程技术得到了广泛应用，并在制药、生物能源、环境保护 等领域发挥了重要作用。重组人胰岛素是一种利用基因工程技术生产的胰岛素， 它与人体产生的胰岛素具有相似的结构和功能。然而，重组人胰岛素的生产过 程比较复杂，需要经过多个步骤，因此生产成本较高。
3、收集：发酵结束后，收集细菌培养液并进行过滤，以去除其中的杂质和细 胞残骸。
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GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
❖启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
存在时，整个操纵子处于基 乳糖 异丙基-β-D-硫
底水平表达；
代半乳糖苷（IPTG）
诱导物可以使启动子Plac 介导的转录大幅提高。
❖过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的 表达。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间 就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功 能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶 在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导 致重组质粒的不稳定性；
高效转录
在正常的细菌培养体系中,除 去色氨酸是困难的，因此基因 工程中往往添加IAA诱导Ptrp 介导的目基因的表达。
Ptrp Otrp Ptrp Otrp
高效转录
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白 阻遏，很难直接诱导控制。在基 Ptrp 因工程中常使用温度敏感型的cI 突变基因cI857控制PL。
基底水平转录 阻遏蛋白
O
诱导
高效转录
PO
乳糖启动子Plac的可控性： cAMP
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促
CAP
Plac
葡萄糖代谢
进Plac介导的转录。
高效转录
O
cAMP浓度降低 基底水平转录
葡萄糖代谢使cAMP减少， 也能阻遏Plac介导的转录。因 此，基因工程中使用的乳糖 启动子均为抗葡萄糖代谢阻 遏的突变型，即Plac UV5。
7. 基因工程的应用
大肠杆菌基因工程 酵母菌基因工程 高等植物基因工程 哺乳动物基因工程
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
细菌与基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次 完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基 因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。
几年后，第一个基因工程产品—利用构建基因的基因工 程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的 产业时代。
对于一些终止作用较弱的终止子， 通常可以采用二聚体终止子串联的特 Apr 殊结构，以增强其转录终止作用；
终止子序列
Tcr pCP1
终止子也可以象启动子那样，从细 菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。
ori 筛选Apr、Tcs的转化子
（三）核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译 起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA 分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达 数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序 列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
1. 核糖体结合位点的结构
四个特征结构要素：
Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻译起始密码子上游的6-8个 核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架 的起始位点,但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；
Plac O
高效转录
Plac UV5 O
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸阻遏蛋白复合物的阻遏，转
阻遏蛋白
录呈基底状态； 在培养系统中去除色氨酸或
Ptrp
除去色氨酸
者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
便可有效地解除阻遏抑制作用。
色氨酸
基底水平转录
Otrp
或加3-吲哚丙烯酸 （IAA）
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌 无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结 构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。
2. 强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上
的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf；
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）启动子
❖启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
启动子
目的基因
E
E
A 酶切开 Bal31酶解
❖启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克
隆到启动子探针质粒pKO1上；
Apr
受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上
细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举 足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史 最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。
7-1. 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落， PL便可介导目的基因的表达. 但在大型细菌培养罐中迅速升温Ptrp 非常困难，因此常使用一个双质粒 控制系统，用色氨酸间接控制目的 基因表达。
阻遏作用
cI857 PL
A
色氨酸
PL
A
目的基因 B
表达 B
（二）终止子
1. 强化转录终止的必要性
❖外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录 过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质 粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物；
pKO1
galK
报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养 ori 基中的半乳糖酵解成红色素物质。
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
❖启动子的构建
启动子
PL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35 区序列
-10 区序列
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA