大肠杆菌基因工程讲解
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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简述大肠杆菌转化法的原理
简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
大肠杆菌的基因型-概述说明以及解释
大肠杆菌的基因型-概述说明以及解释1.引言1.1 概述大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，属于肠道菌群中的重要成员。
它在自然界和人体内广泛存在，并且具有广泛的基因型多样性。
这使得大肠杆菌成为了微生物遗传学和进化生物学领域的研究模型。
在大肠杆菌中，基因型是指该菌株拥有的基因组合和基因的分布情况。
大肠杆菌的基因型可以通过不同的方法进行分类和鉴定。
目前主要的分类方法包括单核苷酸多态性分析、基因片段分析和全基因组测序等。
通过这些方法，我们可以更全面地了解大肠杆菌的基因型组成和种群结构。
大肠杆菌的基因型在其功能和特点方面具有重要意义。
大肠杆菌是一种典型的益生菌，它在人体内具有多种有益作用，包括帮助消化吸收、维持肠道稳定性和参与免疫调节等。
不同基因型的大肠杆菌可能具有不同的功能特点，比如某些基因型可能携带耐药基因或致病因子，导致感染和疾病的发生。
因此，对大肠杆菌基因型的研究有助于我们深入了解其功能机制和生态适应能力。
总之，大肠杆菌作为一种常见的菌株，其基因型具有多样性和重要性。
通过研究大肠杆菌的基因型，我们可以深入探索其功能特点和生态适应能力，进一步促进微生物遗传学和进化生物学的研究。
未来，我们可以通过结合多样的研究方法和技术，进一步挖掘和解析大肠杆菌基因型的奥秘，并探索其在人体健康和疾病中的作用。
文章结构是指文章部分之间的逻辑关系和组织，它有助于读者理解文章的内容和思路。
本文的结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 大肠杆菌的基因型分类2.2 大肠杆菌基因型的功能和特点3. 结论3.1 大肠杆菌基因型的重要性3.2 未来研究的方向文章结构部分是为了描述本文的组织结构，它有助于读者了解文章的内容安排和逻辑关系。
在本文中，我们首先介绍引言部分，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，我们简要介绍了大肠杆菌的基因型。
在文章结构中，我们明确了本文的结构和章节安排，帮助读者理解文章的整体框架。
大肠杆菌转化原理
大肠杆菌转化原理大肠杆菌作为一种常见的细菌，具有广泛的应用价值。
其中，大肠杆菌转化作为一种基因工程技术，是进行基因操作的重要手段之一。
大肠杆菌转化的原理是什么呢？下面就为您详细介绍。
大肠杆菌转化的基本原理是把外源 DNA 引导到受体菌细胞内，并使其稳定地整合到受体菌细胞的染色体中，并且确保该 DNA 在细胞再生过程中倍增遗传。
大肠杆菌转化实验中的基本步骤包括：菌种的培养、DNA 的提取、外源 DNA 与受体菌细胞的共培养、生长选配与富集。
首先，受体菌细胞必须处于生长期，才能够有效地接收外源 DNA。
其次，外源 DNA 可以通过不同的途径转化到受体菌细胞中，例如自然转化、人为电转化、吉尔伯特法、钙磷共沉淀法等。
其中，自然转化是通过外源 DNA 和细胞的相互作用，使得外源 DNA 进入细胞的过程。
电转化是利用电场的力量让细胞壁上的孔隙扩大，从而使得外源 DNA 可以通过孔隙进入受体菌细胞的过程。
吉尔伯特法是利用微量离子钙离子，与 DNA 形成非常稳定的钙离子-DNA 混合物，然后再使得该物质进入受体菌细胞内的过程。
钙磷共沉淀法是先将 DNA 和钙离子混合，然后加入磷酸钠，形成含钙磷沉淀物，最后通过共培养与受体菌细胞结合的技术完成转化。
在转化的过程中，外源 DNA 长度、浓度以及其与受体菌细胞之间的亲和力会直接影响转化的效率。
而大肠杆菌细胞还会出现自发性和诱导性的 DNA 修复和再组合，从而使得外源 DNA 与受体菌细胞在染色体水平上发生重组，对于一些基因的克隆、表达和遗传分析具有重要的意义。
总之，大肠杆菌转化是一种创新的基因操作技术，是现代分子生物学研究的重要手段之一。
通过对大肠杆菌转化原理的深入理解，可以更好地实现基因的修饰、改造和重组，进一步推动生命科学领域的发展和进步。
8基因表达,大肠杆菌基因工程
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’
，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合， 将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子：以AUG；GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列。
C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱
去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，工 艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
人胰岛素的生产方法
利用基因工程菌发酵生产人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素， 成为世界上第一个上市的基因工程药物；1987年，Novo公司又推出
A链和B链分别表达法
基因工程菌的构建战略： 化学合成A链 和B链的编码
Apr
tac
Met b-Gal Met A peptide Apr
tac
Met b-Gal Met B peptide
序列
ori
ori
M
M
M
M
N
C
N
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
b-Gal
外源基因在原核细胞中的表达
现将真核基因在原核细胞中表达： 1、外源基因克隆在表达载体并导人宿主菌。
2、外源基因不能有间隔序列(内含子)，因而必须用cDNA或全
大肠杆菌的分子生物学研究
大肠杆菌的分子生物学研究大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，也是一种广泛应用的模式生物。
在分子生物学研究中，大肠杆菌常常被用作基因工程、蛋白质表达、靶标鉴定等方面的实验材料。
本文将从大肠杆菌分子生物学的视角出发，讲解大肠杆菌相关研究的现状和未来发展方向。
一、大肠杆菌基因组分析对大肠杆菌基因组的分析是分子生物学研究的重要方向之一。
大肠杆菌的基因组长度约为5.5Mb，含有4140个基因。
这些基因可以分为两类：编码蛋白质的基因和编码RNA的基因。
编码蛋白质的基因中，有大约20%的基因是没有已知的功能的，这也是当前研究的重点之一。
大肠杆菌基因组的分析可以通过多种方法实现，包括测序、比较基因组学和功能基因组学研究等。
测序技术是目前最常用的方法，可以得到大肠杆菌基因组的序列信息。
比较基因组学研究则是通过比对大肠杆菌与其他物种的基因组序列，找出它们之间的相同点和不同点，从而了解它们的进化关系。
与之相对应的是功能基因组学研究，它主要关注在基因组层面揭示组织和细胞的功能，包括基因表达分析、蛋白质互作网络研究、代谢通路分析等等。
二、大肠杆菌基因工程研究大肠杆菌基因工程研究是分子生物学研究的另一大方向。
大肠杆菌可以通过基因工程方式来改变其基因结构，从而实现一系列人工合成目的。
例如，利用大肠杆菌来表达蛋白质，就是目前最常用的方法。
首先在大肠杆菌中克隆目标基因，然后将其引入大肠杆菌，最终通过大肠杆菌自身的蛋白质合成机制来合成目标蛋白质。
在基因工程研究方面，重要的工具是质粒。
质粒是一种小而独立的DNA分子，自己携带一些基因，以此与大肠杆菌分子结合，将需要改变的DNA分子或遗传信息被“载入”到大肠杆菌中。
质粒大小一般为1-200kb，基因工程中，通常先将目标基因插入质粒中，再将质粒通过易于使用的接种操作引入大肠杆菌菌体中。
这种基因工程技术可被应用于许多生物医学领域或工业制造方案。
三、大肠杆菌蛋白质结构研究大肠杆菌蛋白质结构研究也是目前分子生物学研究的热点之一。
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第一节 大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标之一是，制备按其它方法难以生产 的大量纯化的蛋白质产物，为此就需要有一种能够高水平表 达异源蛋白质或重组蛋白质的表达系统。而良好的表达系统 的选择要考虑多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白 质产物转译后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水 平和分泌方式等。目前被选作表达异源蛋白质的表达系统有 细菌（包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母、昆虫、植物 和哺乳动物细胞等。
➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生 产。
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌中表达体系表达真核基因的不足：
➢ 真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别，在 大肠杆菌细胞中不可能具有为真核RNA加工剪辑所需要的 酶体系，真核基因很难直接在大肠杆菌细胞中实现功能性 表达；
➢ 通过引进突变的的方法消除细菌中存在的能降解外源真核 蛋白质的蛋白酶分子。
2020/8/16
中英联合实验室
克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：能进行正常的转录和翻译，在正常情况下还与 翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。 重要条件 ➢ 编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性； ➢ 具有核糖体结合位点； ➢ 具有克隆基因的功能（强）启动子； ➢ 插入序列的正确取向
制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）； ➢ 标记：有适合的标记，易于选择； ➢ 安全性：要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内 特殊菌种内才可复制等； ➢ 表达：有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达 ，并且尽可能是高效的表达。
2020/8/16
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性：
➢ 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理 有深刻的了解；
➢ 一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株 和不同类型的载体；
➢ 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、 高水平的表达；
翻译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌偏爱终止子 UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下 ，转译终止的效率将进一步的增强。
➢ 真核基因的转录信号同原核不同。细菌的RNA聚合酶不能 识别真核启动子；外源基因可能含有具有大肠杆菌转录终 止信号功能的核苷酸序列。
➢ 真核基因mRNA的分子结构同细菌有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性和同细菌核糖体相结合的能力，从而阻碍 正常的转录和翻译；
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
2020/8/16
中英联合实验室
第二节 大肠杆菌的表达载体
2020/8/16
中英联合实验室
第二节 大肠杆菌的表达载体
大肠杆菌载体系统 大肠杆菌表达载体的基本成分 常用的大肠杆菌表达载体
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌载体系统
➢ 容量：分子较小，可携带比较大的DNA片段； ➢ 复制：能独立于染色体而进行自主高效的复制； ➢ 酶切位点：有尽可能多的多种限制酶切位点，但每一种限
中英联合实验室
大肠杆菌克隆载体
Vector plasmid λ phage cosmid P1 phage PACs BACs
2020/8/16
Host
E. coli
E. coli E. coli E. coli E. coli E coli
Insert size (kb) <8 9~24
35~45 70~100 100~300 ≤300
2020/8/16
中英联合实验室
翻译起始序列
5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。
在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤 和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突 变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达
2020/8/16
中英联合实验室
翻译增强子
显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率
大肠杆菌Lac操纵子的lac启动子，Trp操纵子的trp启动子及
tac启动子，λ噬菌体的PL和PR启动子以及pBR322载体的β内酰胺酶启动子
➢ 从真核细胞中分离完成加工的mRNA，使用反转录酶合成 出cDNA，并连接到适当的载体上，可以克服真核基因的 间隔子问题；
➢ 根据蛋白质的氨基酸序列，应用化学方法合成出不带间隔 序列的寡聚脱氧核糖核酸的短片段；
➢ 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
➢ 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质 分子，将其降解。
2020/ห้องสมุดไป่ตู้/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达体系
为了克服上述这些问题，已经发展出了许多种不同的方法：
➢ 将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游附近部位，如
中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室
基因工程原理
何光源
2016-04-05
第九章 大肠杆菌基因工程
第一节 大肠杆菌表达体系 第二节 大肠杆菌的表达载体 第三节 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
2020/8/16
中英联合实验室
第一节 大肠杆菌表达体系
2020/8/16
中英联合实验室
中英联合实验室
大肠杆菌表达载体
2020/8/16
中英联合实验室
大肠杆菌表达载体的基本成分
组成部分 ➢ 启动子 ➢ 转录终止子 ➢ 翻译起始序列 ➢ 翻译增强子 ➢ 翻译终止子
2020/8/16
中英联合实验室
启动子
最佳启动子具备的条件：
➢ 必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表 达量占细胞总蛋白的10%~30%以上；
➢ 应能呈现出一种低限的基础转录水平，具有高度抑制性（ 抑制型启动子）；
➢ 应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物得以 诱导（诱导型启动子）。
2020/8/16
中英联合实验室
转录终止子
转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质 产物的水平。
启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用， 当其通过下游启动子时，会使该启动子的功能受到抑制，这 种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象