细胞工程的理论基础

（二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之 为细胞系。
有限细胞系 无限细胞系
(三)克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养
或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细 胞株。
(四)二倍体细胞 培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数 相同或基本相同(2n细胞占75＞或80％以上)的细胞群， 称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限 生命期，故属有限细胞系。
特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与 体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。
传代期
传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞 的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是 有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部 分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一 过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系 （Cell Line）。
2.主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化；
3.提示 要正确认识体外培养细胞
是一种特定条件下生长的细胞群体。
（二）培养细胞的分化
1．不适应(Deadaption)： 表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，
如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的 丧失.
3. 研究的样本可以达到比较均一性
通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系 则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要 时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。
4. 研究内容便于观察、检测和记录
采用各种研究技术、记录方法：
研究: 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流 式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原 位杂交、同位素标记--
HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌) CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) 宫—743：富颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3；美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天传代一次，每次接种3×106细胞／毫 升。
B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有 培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织 块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称 为组织培养。
从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在
生长的同时也发生移动，至使组织培养难 以长时间维持其原有结构，结果也就成了 细胞培养。
C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原 基、器官的一部分或整个器官在体外存活、
（一）核型变化 （二）永生化和恶变 （三）细胞性别
六、体外培养细胞的生存环境
（一）无污染环境 （二）温度 （三）气体环境和氢离子浓度
七、体外培养细胞生存所需基本物质
（一）糖 （二）氨基酸 （三）维生素 （四）促生长因子 （五）其它物质
第三节 建立细胞系或细胞株
一、体外培养细胞的种类和命名
（一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、 组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代 培养(5ubculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改 称为细胞系。
培 养 液：培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)，血
清来源和含量。
细 胞 形 态：类型，如为上皮或成纤维细胞等。
核
型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无。
无污染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等。
物 种 检 测：检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细
胞有否交叉污染。
免 疫 检 测：一两种血清学检测。
细胞建立 者：建立者性名；检测者姓名。
四、细胞培养的缺点
现人工模拟体内环境的技术已经很高,
但, 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全相同. 当细胞被置于体外培养后,
生活在缺乏动态平衡的环境中,
久了，必然发生变化.
因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作 一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和 功能又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将 之与体内的细胞完全等同。
五、细胞培养的工作原则
有标准化的工作方法
培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液 及 抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配 制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名 称、浓度、消毒与否和制备日期等。
一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其 中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已 消毒品与未消毒品应分别存放。
二、建立细胞系（或株）的要求
（一）组织来源 （二）细胞生物学检测 （三）培养条件和方法
三、已建立细胞系或株的签定、管理和使用
培 养 简 历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、
供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。
冻 存 液：培养基和防冻液名称。
细 胞 活 力：融解前后细胞接种存活率和生长特性。
病的治疗等
三、细胞培养的优点
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活 力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分 活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命 活动等。
2. 研究条件可以人为控制
可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、 二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以 施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实 验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺
盛，并能维持二倍体核型。
衰退期 特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，
最后衰退凋亡。
（二）体外培养细胞一代生存期
所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。
潜伏期 指数增生期 停滞期
（三）单个细胞的生长过程
五、体外培养细胞的遗传学特征
单独行动 游离的单独的成纤维
样细胞， 常有几个伸长的 细胞突起
体外培养细胞类型（2）——成纤维细胞型
贴附生长型--类型
1. 与体内同名的细胞不完全相同 如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源
自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但
发展趋向不同 2. 培养细胞的形态不稳定
条件改变，细胞形态可有变化
培养细胞形态不稳定
第二章 细胞工程的理论基础
山东师范大学生命科学学院
动物细胞与组织培养（cell and tissue culture） 是动物细胞工程的重要技术基础。
动物的细胞与组织培养是指从活的机体中 取出组织或细胞，模拟机体内生理条件， 在体外建立无菌、适温和一定营养条件等， 使之生长和生存，并维持其结构和功能的 技术。
来源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能
特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团
优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态
缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
三、培养细胞的生长特点
（一）贴附 （二）接触抑制 （三）密度抑制
四、培养细胞的生长和增殖过程
（一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells)
所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长 的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。
正常培养的细胞周期
原代培养(Primary Culture)期 也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一 次传代阶段，一般持续1-4周。
其它，不定型
上皮细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞
如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核
生长特点
易相连成片
相靠—紧密相连—成
薄
层
—
铺石状
生长时呈膜状移动
很少脱离细胞群而单 个活动
体外培养细胞类型（1）——上皮细胞型
血清 Hela
高血清
低血清
成纤维细胞样 上皮样细胞
pH Hela 太酸或太碱 标准pH
成纤维细胞样 上皮样细胞
细胞密度 3T3 低密度
高密度
成纤维细胞样 上皮样细胞
生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮
圆形
转化与否未转化
成纤维样
贴附
成纤维或上皮样
转化后
可成上皮样
悬浮生长型
概念
培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长
组织培养的概念
组织培养这一名词实际上是一个通用名词， 习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物 的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、 组织培养和器官培养。
A：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法 分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养 于固体基质上，成单层细胞生长，或在培 养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培 养。
绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞
和白细胞可在悬浮状态下生长。
贴附(粘附)型细胞
粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式
含义 两方面
结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，
有机体的绝大多数细胞必须
粘附于一固相表面 才能生存和生长。
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于 某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。
粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附 于固相表面才能生存的细胞
类型
细胞在体内、外的粘附方式：存在差异
体内：粘附是全方位
外形具有复杂的立体特征
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面
外形一般与体内时明显不同
按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型
分类
根据形态大致的不同，主要2类：