第三章基因工程的酶学基础文稿演示

4．限制酶的特性
a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关； b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只
具一个限制位点的质粒）。
二、Ⅱ型酶
1. II 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列， 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧， 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构
第三章基因工程的酶学基础文稿演示
优选第三章基因工程的 酶学基础
一、限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease）
这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定 核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷 酸内切酶
１．寄主控制的限制（restriction）
R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
２．限制性内切酶的分类
• 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解 外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干 扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因 工程重要的工具酶。
• 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA 的特点，可以将限制性内切酶分为三类： • Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和 E.coliK中分离出的核酸内切酶。
分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫 氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位 点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的， 所以在基因工程中应用不大。
与修饰 (modification) 现象
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些 功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制与修饰现象 简称（R/M体系）
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的 DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉
R/M体系：
寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5 ‘…G C T G A A T T C G A G … 3’ 3 ‘…C G A C T T A A G C T C … 5’
EcoRI等产生的5 ‘粘性末端
5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
5‘…G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘…C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
2.核酸内切酶作用后的断裂方式
（ 1 ） 粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错 地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式 的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。
识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也 在这一回文对称结构上。
许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端， 有利于DNA片段的重组。
主要特性 I 型
II型
III 型
限制修饰 多功能
单功能
双功能
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+ SAM
Mg2+
Mg2+ SAM ATP
识别序列 切割位点距
TGAN8TGCT AACN6GTGC
距识别序列1kb 处随机性切割
旋转对称序列
识别序列内或附近 特异性切割
GAGCC
CAGCAG
识别序列下游24-26bp处
3.限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母： 大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母 其它字母： 大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号 罗马数字： 表示该菌株发现的限制酶的编号
P OH
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH 3‘…C-G-A-G-P
退火4-7 ℃
P-G-G-A-G … 3’ OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
OH P
5‘…G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘…C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
P OH
PvuII等产生的平头末端
5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
PvuII 37 ℃
EcoRI 37 ℃
5‘…G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
退火4-7 ℃
OH P
5‘…G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘…C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
பைடு நூலகம்
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中
有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。
而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但
可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨 酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱 基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化 的序列。
Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的 3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点 也是没有特异性的。
Ⅱ型酶
1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株 中分离出来的限制酶。
分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同 源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且 具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中， 得到广泛的应用。
例： EcoR I: 来自于Escheria coli RY13 的第一个限制酶
1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 HindII和HindIII
属名
种名 株名
Haemophilus influenzae d
嗜血流感杆菌d株
H i n d II H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制 性核酸内切酶