硝化细菌的分离纯化

材料与方法

样品

检测用试剂

1、Griess 试剂

溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。

溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。

格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上，

依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有

亚硝酸细菌存在。

2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在）

称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。

由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基

1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）

酵母粉 5g 蛋白胨 10g

NaCl 10g 蒸馏水 1000ml

灭菌前pH=7.3

2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）

酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g

牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml

灭菌前pH=7.3

3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）

马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g

水 1000mL

灭菌前pH自然

硝化细菌培养基

富集培养

取样品0.5g于有50ml灭菌培养基的250ml三角瓶在恒温30℃，摇床转速为150r／min，条

件下富集培养。每周一次，用Griess试剂(或二苯胺-硫酸试剂)定性检测HN02(或HN03)的生

成情况，判断富集情况的好坏。培养1周后用灭菌的5%的硫酸铵溶液补料一次。培养2周后，转接新鲜的培养基，接种量20％(因为硝化细菌生长特别缓慢，为了尽量富集多的培养物，

故选择较高的接种量)。如此反复多次移植传代，但第二次传代后,接种最要减少,以0.5-1ml为宜。经过7次传代后,转接后期补料频率可以加大。经此过程后定量测定每个富集样品中

HN02(或HN03)的量，选择富集最好的样品进行下一步的分离操作。

硝化细菌的分离培养

选取颜色显深的富集培养菌液，采用划线法进行平板分离培养，在30℃恒温条件下黑暗培养

平板要密封防止平板干裂，观察菌落生长情况，待长出针尖大小的菌落后，挑取单菌落至分

离平板，重复划线分离3次，分离培养过程中设空白对照。如果平板内仍然有其他菌落生成

可以将其疑似硝化细菌菌落挑在液体培养基中再次培养并检测重复划线分离直到得到形态一

致的菌落为止。

纯度检测

将筛选的菌株用LB、KM或PDA培养基划线培养验证是否有杂菌若有杂菌则需要进一步划

线分离，直到分离到纯菌。

菌落形态观察

将的到的菌落进行观察并记录做表。

细胞形态观察

将筛选的细胞进行革兰氏染色在油镜下观察并记录。参照伯杰氏细菌鉴定手册

保藏

1、斜面保藏

将已纯化的硝化细菌菌液用接种环在硝化细菌固体培养基斜面上划线，于30℃培养，待长出

菌落后，置于4"C冰箱冷藏，3一4月转接1次。

2、室温直接保藏

将培养好的硝化细菌菌液直接置于室温避光保藏即可。每隔3～4月转接1次。