乳酸菌的分离培养
食品中乳酸菌的分离鉴定及功能研究
食品中乳酸菌的分离鉴定及功能研究近年来，随着人们健康意识的提高，对于食品中乳酸菌的分离鉴定及功能的研究逐渐受到关注。
乳酸菌是一类广泛存在于食品中的有益菌群，具有许多对人体有益的功效，其鉴定与功能研究对于食品质量的提升和人类健康至关重要。
首先，乳酸菌的分离鉴定是研究乳酸菌功能的基础。
在食品中分离鉴定乳酸菌，可以帮助我们了解不同种类、不同来源食品中乳酸菌的种类和数量。
常见的分离鉴定方法包括传统的培养分离方法、分子生物学方法和基因测序技术等。
其中，传统的培养分离方法是最常用的一种方法。
通过在不同的培养基上进行培养，分析菌落形态、生理和生化特性，可以初步鉴定出乳酸菌的种类。
而分子生物学方法则可通过引物对乳酸菌特异基因进行扩增和检测，进一步确定其种类。
基因测序技术则可以更加准确地鉴定不同乳酸菌的种类和亲缘关系，为进一步深入研究乳酸菌功能奠定基础。
其次，乳酸菌的功能研究主要包括保健、抗菌和抗氧化等方面。
乳酸菌具有胃肠道保健功能，可以维护肠道的健康平衡，促进食物的消化吸收，降低胃肠道疾病的风险。
此外，乳酸菌还具有抗菌作用，特别是对肠道中的有害菌起到抑制作用，有利于维持肠道菌群的稳定。
同时，乳酸菌还具有一定的抗氧化功能，可以清除自由基、减少氧化应激，保护人体细胞免受氧化损伤。
乳酸菌的功能主要通过其代谢产物来实现。
乳酸菌代谢产物包括乳酸、抗菌物质、挥发性化合物和细胞外多糖等。
其中，乳酸是乳酸菌最主要的代谢产物之一，可以维持肠道的酸碱平衡，抑制有害菌的生长。
抗菌物质则可以直接杀灭或抑制有害菌的生长。
挥发性化合物则赋予乳酸菌独特的风味和香气，为食品增色不少。
细胞外多糖则具有一定的黏附能力，有助于乳酸菌在肠道中生存和繁殖。
针对乳酸菌的功能研究还包括乳酸菌的应用。
乳酸菌可以被广泛应用于食品工业，通过发酵食品，不仅可以制造出更多种类的美味食品，还可以增加食品的营养价值和保质期。
此外，乳酸菌在医学领域也有着广泛的应用前景。
研究表明，乳酸菌在预防和治疗肠道疾病、免疫调节、降低胆固醇、抑制肿瘤等方面具有潜在疗效。
发酵实验报告三、乳酸菌的分离和酸奶的制作
发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作学院生命科学学院专业应用生物教育班级12应生A班姓名李顺昌学号124120218实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作指导教师许波开课学期2014—2015学年下学期实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤一、实验目的1.掌握分离纯化微生物的基本方法2.掌握酸奶制作的基本原理3.学会酸奶的制作方法二、实验设备与材料1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。
2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。
3、培养基：乳酸菌分离用乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。
配制250mL/组，装于2个三角瓶三、实验原理1、酸奶制作的基本原理（1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。
（2）生理生化原理牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。
3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。
四、实验方法步骤（一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法1、倒平板（约6块/100ml）2、制备酸奶稀释液（1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min；（2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液；（3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液；（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。
泡菜中两株乳酸菌的分离鉴定及其混合培养初探
（ 山东省 农业科学院农产品研究所／ 国家粮 油加工技术研发分 心 ， 山东 济南 ２０ ０ ） ５ １０
摘
要 ： 自然发酵的泡菜 中分离到两株耐 酸性 乳酸 细菌 Ｂ １ Ｂ ２ 从 Ｌ 和 Ｌ 。两种乳 酸菌在 ＭＲ Ｓ发 酵培养基
中发酵 ２ ， ４ｈ 发酵液 ｐ Ｈ值 可以降到 ３５以下 。根 据形态 和生理 生化特 征 ， ． 将两种 乳酸菌初 步鉴定 为乳杆菌
乳酸菌菌种的分离筛选原理
乳酸菌菌种的分离筛选原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，广泛应用于食品、饲料、医药等领域。
乳酸菌菌种的分离筛选是乳酸菌应用研究中的重要一环，其目的是从大量的混合菌群中筛选出具有优良特性的菌株。
乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基：乳酸菌菌种对营养要求较高，因此选择适宜的培养基是分离筛选的首要步骤。
常用的培养基有MRS培养基、DC培养基等，它们含有适宜乳酸菌生长的营养成分，能提供所需能量和营养物质。
2. 适宜的培养条件：乳酸菌对培养环境的温度、pH、氧气和二氧化碳等条件有一定要求。
通常情况下，乳酸菌分离筛选需要在适宜的温度（一般为30-40）下进行，pH值保持在4.5-7.0之间，氧气和二氧化碳含量适中。
3. 分离方法：乳酸菌菌种的分离常采用传统的分离培养技术，如层析法、稀释平板法、摇瓶培养法等。
其中，层析法是一种常用的快速分离方法，通过将混合菌群在筛选培养基上涂抹或刺激，使不同菌株在筛选培养基上形成分离的菌落。
4. 鉴定鉴别：乳酸菌菌种的筛选与鉴定是不可分割的一步，只有确定菌株的种属和特性才能真正确认其乳酸菌的菌种类型。
目前，常用的鉴定方法包括形态学观察、生理和生化特性检测、分子生物学方法（如PCR技术、16S rDNA序列分析）等。
在乳酸菌菌种的分离筛选过程中，还需要注意以下几个问题：1. 选择样品：样品的选择对于乳酸菌菌种的分离筛选至关重要。
通常情况下，从乳制品、肠道、土壤等环境中寻找潜在的乳酸菌菌种，可以提高分离到优良菌株的几率。
2. 优化培养条件：对于特殊的乳酸菌菌种，可能需要优化培养条件，如调整温度、添加特定的营养成分等，以促进其生长和繁殖。
3. 评价筛选结果：乳酸菌菌种的分离筛选结果需要综合考虑其特性和应用价值。
如菌株的酸奶生产能力、耐酸碱能力、抗菌能力、抗氧化能力等。
总结起来，乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括选择合适的培养基和培养条件、采用适当的分离方法和鉴定鉴别技术。
酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定
所以酸奶菌落总数为： 样品的测定与出厂的间隔时间为3d： N=(N1+N2) X A/2=（295+297）X 107/2=296 X 107cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为6d： N=(N1+N2) X A/2=（273+271）X 107/2=272 X 107 cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为9d： N=(N1+N2)X A/2= （ 212+213 ） X 107/2= 213 X 107cfu/mL 实验分析：酸奶中所含的乳酸菌数，随着 出厂天数的延长会出现明显下降的趋势。
测定乳酸菌的 OD值和产生酸能力来评定酸乳中乳酸菌的活力，
2. 材料与方法
材料与设备
A B 设备：高压灭菌锅 CO2培养箱 电子天平 冰箱 鼓风干燥箱 超净工作台 光学显微镜
材料：蒙牛冠益乳
实验方法
酸奶中乳酸菌的 培养分离 生化试验鉴定 酸奶中乳酸菌
乳酸菌
菌落数的测定
生长曲线的绘制
产酸能力的测定
目录
1 2 3 4 5
概述 材料与方法 结果与分析 结论 致谢
1. 概述
背景
酸奶是日常生活中的一种传统的受欢迎的 发酵型的乳制品，它的营养价值含量相当 的丰富，并且对人体有很好的保健功效。
意义
蒙牛冠益乳中的乳酸菌主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。 对乳酸菌活力的测定，判定酸奶的最佳饮用时间，为酸奶的消 费提供科学的依据，同时也对微生物做出研究。
发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定
发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌是一类重要的微生物，在食品发酵过程中扮演着不可替代的角色。
乳酸菌不仅能够提高食品的营养价值，还具有促进肠道健康、增强免疫力等益生作用。
因此，分离和鉴定发酵食品中的乳酸菌是食品科学领域中的一项重要研究内容。
要进行乳酸菌的分离与鉴定，首先需要从发酵食品样品中分离乳酸菌。
一般而言，我们可以选择将样品通过稀释后接种于选择性培养基上，以便只有乳酸菌能够生长。
接种后，将培养基放置于适宜的温度下，培养一段时间。
乳酸菌具有较强的酸性产生能力，因此在培养过程中会形成明显的酸性环境。
可通过测量培养基的pH值来初步判断是否有乳酸菌生长。
在分离乳酸菌的培养基上，我们可能会观察到许多不同形态的菌落。
这些菌落在形状、颜色、质地等方面可能存在差异。
我们可以选择几个具有代表性的菌落进行后续的鉴定。
对于乳酸菌的鉴定，有许多方法可供选择。
一种常用的鉴定方法是形态学观察。
乳酸菌具有一些特征性的形态特征，如菌落的形状、边缘的特点、质地的柔软程度等。
此外，乳酸菌的细胞形态也具有一定的特征，如形状、大小、胞内结构等。
通过在显微镜下观察乳酸菌的形态特征，可以初步判断其种属。
除了形态学观察外，乳酸菌的生理生化特性也是鉴定的重要依据。
例如，乳酸菌通常能够在不产生气体的条件下发酵葡萄糖。
此外，乳酸菌对于一些特定的碳源、氮源等具有较强的利用能力。
通过对乳酸菌进行代谢特性的测试，可以进一步确认其种属。
分子生物学方法也为乳酸菌的鉴定提供了新的手段。
通过对乳酸菌的DNA进行提取和PCR扩增，可以得到乳酸菌的16S rRNA序列。
将这些序列与已知种属的乳酸菌进行比对，可以准确鉴定乳酸菌的种属。
在发酵食品中，常常存在多种乳酸菌同时存在的情况。
因此，对于从发酵食品中分离到的乳酸菌，进行种属鉴定是至关重要的。
只有确定了乳酸菌的种属，才能更好地利用其在食品工业中的潜力。
发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定是一项科学而有趣的工作。
通过对乳酸菌的研究，我们可以更好地了解乳酸菌在食品发酵过程中的功能和作用，为食品工业的发展提供更多的可能性。
酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化ppt课件
【实验材料、仪器与试剂】
实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。 实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、 培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。 实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 琼脂、无菌水
【实验步骤】
1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备
2、脱脂乳试管的制备
3、酸奶中乳酸菌的分离 4、乳酸菌的检测、纯化培养
（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备
配料： （A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g ，pH6.8， 121℃湿热灭菌20min。 操作： （1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水 量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，加琼脂溶化，加 热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后 倒入250mL的锥形 瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。 （2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板 。
10ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
10-1
花园酸奶 90ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进 行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
B．平板涂布
乳酸菌分离鉴定及试验方法
乳酸菌分离鉴定及试验方法一、引言乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，具有重要的生物学功能和应用价值。
乳酸菌可以通过发酵作用，将葡萄糖、果糖等碳源转化为乳酸和其他有机酸，同时还会产生一些对人体有益的物质，如维生素、酶、抗生素等。
乳酸菌在食品工业、医药工业、农业等领域具有重要的应用前景。
乳酸菌的分离鉴定及试验方法对于深入研究乳酸菌菌种的特性、功能以及在不同领域中的应用具有重要意义。
本文将介绍乳酸菌的分离鉴定及试验方法，旨在为相关研究人员提供参考和指导。
二、乳酸菌分离方法1. 采样乳酸菌的分离首先需要进行采样工作。
可以从发酵食品、乳制品、蔬菜、水果、土壤、肠道等多种来源进行采样。
在采样过程中应注意样品的新鲜性和卫生性，避免外部污染对实验结果造成影响。
2. 培养基的选择乳酸菌可以利用多种培养基进行分离和培养，常用的培养基有MRS培养基、乳清培养基等。
根据具体的分离目的和需求选择适合的培养基。
3. 分离将采样得到的样品进行系列稀释，取适量的稀释液均匀涂布在含有适当培养基的琼脂平板上，培养温度一般在30-37摄氏度之间，培养时间约48-72小时。
4. 纯化观察培养基上的菌落形态，选择典型的菌落进行分离单菌培养，通过多次传代稀释可以纯化获得纯种的乳酸菌。
5. 形态观察利用显微镜对分离得到的菌株进行形态学观察，包括细胞形状、大小、排列方式等。
三、乳酸菌鉴定方法1. 生理生化鉴定通过对分离得到的菌株进行生理生化特性的研究，包括乳酸发酵能力、氧耐受性、温度、pH值的适应能力等，可以初步判断乳酸菌的种属。
2. 生化试剂法利用生化试剂对乳酸菌进行鉴定，如气体发生试验、氧化还原酶试验、酶活性试验等。
3. 分子生物学鉴定通过PCR扩增乳酸菌的16S rRNA基因序列，测序后与数据库比对，确定乳酸菌的种属分类。
四、乳酸菌试验方法1. 发酵活性测定通过测定菌株在不同条件下的发酵活性，如发酵速率、产酸速率、产酶能力等。
2. 抗菌活性测定测定乳酸菌对一些有害菌的抑菌作用，判断其在抗菌方面的潜力。
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乳酸菌的分离培养保加利亚乳杆菌组长：组员：实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。
4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。
5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。
6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。
明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。
实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。
通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。
酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。
细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。
用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。
实验器材：样品：含乳酸菌的酸奶①培养基：改良MRS固体培养基蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。
仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只15ml试管7只高压灭菌锅天平水浴锅一个玻棒一根旋涡均匀器一台镜台测微尺电磁炉一个棉花纱布目镜测微尺牛皮纸麻绳接种环一个盖玻片酒精灯一盏牛角匙pH试纸血球计数板载玻片若干恒温培养箱酸度计擦镜纸、吸水纸液体石蜡显微镜载玻片玻片架、洗瓶、酒精灯火柴、滴管药品：结晶紫，乙醇，草酸铵，碘，碘化钾，番红，KOH，NaCl，10％NaOH，2%氯化铁。
药品配制结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1g草酸铵于蒸馏水100ml。
将两液混匀即成。
卢戈氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。
蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。
用时取10ml与80ml蒸馏水混匀即可。
0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。
混合A和B液即成，按1：100稀释即可。
生理盐水：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。
实验步骤：一、培养基的培养1．称量用天平称取蛋白胨1g, 牛肉膏1g , 酵母提取物0.5g ,柠檬酸二铵0.2g,乙酸钠0.5g , K2HPO4 0.2g, MnSO4·4H2O 0.025g, MgSO4·7H2O 0.06g , 葡萄糖2g , 吐温80 0.1mL , CaCO3 1g放入烧杯。
2．溶解向上述烧杯中加入蒸馏水50 mL无菌水，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热,在石棉网上加热溶解后,加入2.5g琼脂，并继续用微火加热。
在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。
待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。
3．调节pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸测pH，直到pH到6.8左右。
4．过滤要趁热用四层纱布过滤5．培养基的分装将培养基趁热分装到2个三角瓶里(一半为宜)。
注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。
6．加棉塞培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。
棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。
加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。
7．包扎在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。
在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名二、灭菌1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜（直至高水位灯亮起）。
2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。
（注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果）。
3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。
（以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气）同时关闭灭菌锅上方的安全阀，打开排气阀，使水沸腾时得以排除锅内的冷空气。
4．设置灭菌温度和时间。
温度为121℃,20分钟灭菌5．排出锅内的冷空气，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内的压力上升到98kPa 时，控制火力大小，使压力维持在98kPa左右20min。
6．灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力将至0时，打开排气阀，旋开盖子，取出灭菌物品。
三、无菌检查将取出的灭菌培养基放入37℃温箱保温培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
四、菌悬液的配制先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇20分钟，使样品均匀分散。
用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml酸奶悬液注入9ml无菌水的试管中，吹息三次，使充分混匀。
然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各种稀释度的菌悬液（要取7只15ml试管）。
五、倒平板取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。
六、分离方法A．涂布平板法用三支1ml无菌吸管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.2ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放与试验台上20 Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
B．平板划线1、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，按无菌操作对标有‘10-1‘的3个平板进行划操作。
常用的划线方法有;(a)用接种环以无菌操作挑取菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。
（b）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。
C．稀释混合平板法先分别吸取1ml的10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液对号放入平板中，然后再倒入经高温消毒的并冷却到50℃左右培养基中，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，到冷凝成平板后，倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
七、菌落特征的观察恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态（如菌落的大小、表面状况、透明度、色泽、边缘、隆起度、透光性、是否分泌色素等特点）进行观察，初步找出乳酸菌菌落。
乳酸菌的菌落很小，大约1~3 mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。
八、乳酸菌的形态观察及保加利亚乳杆菌的形态观察（一）普通光学显微镜的使用1.取镜从显微镜箱中取出显微镜时，用一手握镜臂，一手托镜座，直立移动，轻放在平稳的实验台上，使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否齐全，镜头是否清洁，做好必要地清洁和调整工作。
2.调节光照1) 用粗调节器提升镜筒，将低倍物镜旋到镜筒下方，使镜头和载物台距离约为5mm左右。
2) 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。
3) 插上电源，开开电源开关。
左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜）。
4) 开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的光度为止。
3.低倍镜观察1) 将载片标本（涂面朝上）置于载物台的标本夹上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节器，使镜头下降至镜面距离检视物大约5mm处。
2) 然后以左眼看目镜，另一眼睁开，一边观察视野，一边扭动粗调节器使镜头缓慢地升高，至视野内出现物像后，改用细调节器上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物像，选择适宜部位，移到视野中心。
3) 移动推动器，换高倍镜观察。
4.高倍镜观察将高倍物镜转至镜筒下方，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。
5.油镜观察1) 先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。
在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。
2) 左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下将载物台，当视野中有模糊地标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。
3) 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦擦镜纸蘸少许二甲苯或乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份），擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下即可，（注意向一个方向擦拭）。