乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸菌的筛选
乳酸菌的筛选（初筛）一、实验目的对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。
二、实验材料PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。
三、实验步骤1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。
2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。
3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10-4、10-5梯度菌液进行平板涂布。
4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。
5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。
乳酸菌的筛选一、实验目的利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。
二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。
通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。
实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
四、实验步骤1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。
2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。
产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定
取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。
纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。
用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。
１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。
１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。
以空白培养基为对照，扣除背景干扰。
’１．２。
６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。
１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。
乳酸杆菌的分离、鉴定及体外拮抗试验
１ 材 料 与方 法 １１ 材料 ．
１ 实验仪器 培养皿 、 ～１ １ 移液管 、 牛津杯 、 微型 发酵 管（ 空管 ）针头 、 、 试管 、 蒸馏水 、 三角棒、 微量加样 枪枪 头、 注射器、 心管等器具 ， 已作高压湿热灭菌。 离 均
１１ 培养基 ．２ ． Ｌ Ｓ乳酸杆菌选择培养基 的制备 ： Ｂ 蛋
红、 美蓝混匀，２ 灭菌 １ ｍ ｎ １ １Ｃ ｏ ５ ｉ。
２１ 乳 酸杆 菌的分 离纯化结果 ．
在 Ｌ Ｓ划线培养的 Ｂ
菌株 中随机挑选 １ 菌株 ， 株 进行纯 化培养 ， 鸡粪菌株 代号为 Ｌ Ｊ Ｂ 、猪粪菌株代号 为 Ｌ Ｚ Ｂ 、牛粪菌株代号 为
Ｌ ＢＮ。
营养琼脂培养基 的制备 ： 牛肉膏 １ － 白胨 ２ 、 蛋 ｇ ｇ
前 为淡紫色 ， 阳性反应为黄色 ， 阴性反应为深红色。以
上微量 发酵 管除精氨酸外 ， 其余都为糖 、 醇发酵 ， 精氨
分别取猪粪 、牛粪、 鸡 酸发酵是为 了验证 有无氨气产生 ，接种前为绿色 ， 阳
１ ． 乳酸杆菌 的分离纯 化 ．１ ２
粪约 １ ， ９ ｍ 加 ９ Ｌ生理 盐水 ， ｇ 室温下 １０ ／ ｉ ５ ｒ ｎ摇床振 ｍ 摇 ｌ～ ０ ｉ。分别在 Ｌ Ｓ培养基上划线 ，将划线的 ５３ ｎ ｍ Ｂ
ｌ ｔ ａｉｕ ｙ ｓｓａｄ ｔｅＣＷ ｓｕ ｅ ｌ ｔ ａｉｕ ｒ ｈｃ ｓｈｄ ｎ ｉ ｏ ｃ ｔｇｎｓｃａｔｎ ｔ ａ ｏ ｃｌｓｘｌ ｕ ｎ ｈ Ｏ ｏｒ ａ ｏ ｃｌｓｔｃｏｔ ａ ｏｂｏ ｇ ａ ａ ａｏｉｉ ｃｏ ｏ ｃｂ ｌ ｏ ｃ ｃｂ ｌ ｉ ｅ ｌ ｌ ｎ ｉ ｔ ｉ
０ ｇ七水硫酸镁 ０ ４ 、 ．、 ４ ． ｇ 四水硫酸镁 ０ １ 、 ０ ． 琼脂粉 ０ｇ
苯乳酸的乳酸菌分离筛选及菌种鉴定
１．１试验材料 １．１．１样品采集
泡菜样品购自无锡天润发超市。 １．１。２培养基
ＭＲＳ培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２０，酵母膏５，蛋白 胨１０，牛肉膏１０，Ｋ：ＨＰＯ。２，乙酸钠５，柠檬酸二铵 ２，ＭｇＳ０４·７Ｈ２０ Ｏ．５８，ＭｎＳＯ。·４Ｈ２０ Ｏ．２５，吐温 ８０ １ｍＬ。调ｐＨ至６．２～６．４。
苯乳酸（ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ，ＰＬＡ），也称３一苯基乳 酸或ｐ一苯乳酸，即２一羟基一３一苯基丙酸，是近年来发现 的一种新型天然防腐剂。１９９８年，Ｄｉｅｕｌｅｖｅｕ Ｘ［１］发现 白地霉（＆ｏ￡矗ｃ，Ｌ“ｍ ｆ彻ｄｉｄ“ｍ）发酵的干酪对单核 细胞增生李斯特菌（“５抛ｒ如ｍｏ规ｏｃｙ￡ｏｇＰ７２ｅｓ）有很强 的抑制作用，通过分离、鉴定，最终确定苯乳酸是其中 的主要抑菌物质。２００３年，Ｌａｖｅｒｍｉｃｏｃｃｏ［２３研究了苯 乳酸对多种引起食品腐败的真菌的作用，发现其有宽 广的抑菌谱，如抑制黑曲霉（ＡｓｐＰ，．ｇ删“ｓ行ｉｇｅｒ）、黄 曲霉（Ａｐ已ｒｇ删淞．∥ｎ铆甜ｓ）、娄地青霉（Ｒ佗ｉｃⅢｉ“ｍ ｒＤｇ粥．加以ｉ）等。与Ｎｉｓｉｎ（乳链球菌素）相比，苯乳酸 抑菌谱宽，能抑制多种食源性致病菌、腐败菌，特别是 能抑制真菌污染；溶解性好，易于在食品体系中扩散； 稳定性高，具有宽广的ｐＨ范围和热稳定性，这些优 点决定了它在食品工业具有广阔的应用前景［３￣５］。
万方数据
图４
Ｌｎｃ￡ｏ机ｃｉＺＺ“ｓ ｓｐ．ＳＫ００７ １６Ｓ ｒＤＮＡ
序列的系统发育树
！！！！望蔓塑鲞蔓！塑（璺蔓！！旦塑２ｌ ３
■盈国霉幽！望Ｑ里垒塑！！！坚！堕！垒！！型！蔓望旦！！！！型
同。把１６Ｓ ｒＤＮＡ作为鉴定依据的是其中的可变区， 因此截去序列两端保守区的一些小片段不会影响结 果，所以利用Ｃ１ｕｓｔａｌｘ做的系统发育树较为可信。 此外，结果表明，用１６Ｓ ｒＤＮＡ序列鉴定乳酸菌时较 适用于属以上的分类单位，但对属以下的分类单位， 如种和亚种就显得分辨率不足。
乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
乳酸菌菌种的分离筛选原理
乳酸菌菌种的分离筛选原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，广泛应用于食品、饲料、医药等领域。
乳酸菌菌种的分离筛选是乳酸菌应用研究中的重要一环，其目的是从大量的混合菌群中筛选出具有优良特性的菌株。
乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基：乳酸菌菌种对营养要求较高，因此选择适宜的培养基是分离筛选的首要步骤。
常用的培养基有MRS培养基、DC培养基等，它们含有适宜乳酸菌生长的营养成分，能提供所需能量和营养物质。
2. 适宜的培养条件：乳酸菌对培养环境的温度、pH、氧气和二氧化碳等条件有一定要求。
通常情况下，乳酸菌分离筛选需要在适宜的温度（一般为30-40）下进行，pH值保持在4.5-7.0之间，氧气和二氧化碳含量适中。
3. 分离方法：乳酸菌菌种的分离常采用传统的分离培养技术，如层析法、稀释平板法、摇瓶培养法等。
其中，层析法是一种常用的快速分离方法，通过将混合菌群在筛选培养基上涂抹或刺激，使不同菌株在筛选培养基上形成分离的菌落。
4. 鉴定鉴别：乳酸菌菌种的筛选与鉴定是不可分割的一步，只有确定菌株的种属和特性才能真正确认其乳酸菌的菌种类型。
目前，常用的鉴定方法包括形态学观察、生理和生化特性检测、分子生物学方法（如PCR技术、16S rDNA序列分析）等。
在乳酸菌菌种的分离筛选过程中，还需要注意以下几个问题：1. 选择样品：样品的选择对于乳酸菌菌种的分离筛选至关重要。
通常情况下，从乳制品、肠道、土壤等环境中寻找潜在的乳酸菌菌种，可以提高分离到优良菌株的几率。
2. 优化培养条件：对于特殊的乳酸菌菌种，可能需要优化培养条件，如调整温度、添加特定的营养成分等，以促进其生长和繁殖。
3. 评价筛选结果：乳酸菌菌种的分离筛选结果需要综合考虑其特性和应用价值。
如菌株的酸奶生产能力、耐酸碱能力、抗菌能力、抗氧化能力等。
总结起来，乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括选择合适的培养基和培养条件、采用适当的分离方法和鉴定鉴别技术。
乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究
乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究摘要:乳酸菌是一类具有多种生理功能的细菌，本文通过阐述乳酸菌不同来源的分离鉴定方式，探讨了乳酸菌的部分主要生理功能。
关键词:乳酸菌分离鉴定功能Abstract: Lactic acid bacteria are a kind of many physiological functions of bacteria, this paper explains the separated and identified from different sources of lactic acid bacteria, and probes into the way of its part main physiological function.Keywords: lactic acid bacteria separated and identified function乳酸菌是一类广泛分布于自然界、与人类生活密切相关、可发酵碳水化合物、产生乳酸的细菌，然而，乳酸菌的许多特性是由其基因编码决定的【1】，利用这一特性，人们可以用乳酸菌作为载体，在食品及医药领域中构建表达系统。
乳酸菌具有控制肠道感染，改善乳糖代谢，增加某些食物的营养价值，诱导体内特异性及非特异性免疫等作用。
乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状，生殖方式为裂殖，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸分解蛋白质，但不产生腐败产物，不形成内生孢子，无运动性或极少运动，目前己发现的乳酸菌在细菌分类学上有18个属【2】。
通过对乳酸菌分离鉴定，可测定其生理功能。
一、乳酸菌的分离鉴定乳酸菌的来源广泛，腌菜、发酵肉制品、腐乳、酱醅、牛乳等食物中乳酸菌的含量极其丰富。
（一）腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌广泛存在于泡菜和腌菜等食品中，此类乳酸菌较耐盐，因此，以腌菜为样品，分离优良乳酸菌株，将其应用到含盐量较大的食品中，可以改善食品的风味，提高食品的质量。
酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定
所以酸奶菌落总数为： 样品的测定与出厂的间隔时间为3d： N=(N1+N2) X A/2=（295+297）X 107/2=296 X 107cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为6d： N=(N1+N2) X A/2=（273+271）X 107/2=272 X 107 cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为9d： N=(N1+N2)X A/2= （ 212+213 ） X 107/2= 213 X 107cfu/mL 实验分析：酸奶中所含的乳酸菌数，随着 出厂天数的延长会出现明显下降的趋势。
测定乳酸菌的 OD值和产生酸能力来评定酸乳中乳酸菌的活力，
2. 材料与方法
材料与设备
A B 设备：高压灭菌锅 CO2培养箱 电子天平 冰箱 鼓风干燥箱 超净工作台 光学显微镜
材料：蒙牛冠益乳
实验方法
酸奶中乳酸菌的 培养分离 生化试验鉴定 酸奶中乳酸菌
乳酸菌
菌落数的测定
生长曲线的绘制
产酸能力的测定
目录
1 2 3 4 5
概述 材料与方法 结果与分析 结论 致谢
1. 概述
背景
酸奶是日常生活中的一种传统的受欢迎的 发酵型的乳制品，它的营养价值含量相当 的丰富，并且对人体有很好的保健功效。
意义
蒙牛冠益乳中的乳酸菌主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。 对乳酸菌活力的测定，判定酸奶的最佳饮用时间，为酸奶的消 费提供科学的依据，同时也对微生物做出研究。
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乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
2.溴甲酚绿指示剂法：培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。
二.菌种的分离筛选1.培养基：★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L 预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH 自然（分离用）★★1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖10g/L 吐温0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01% PH6.0-6.5（分离用）★1.3番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分离用）1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.51.5蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5-2.0g/LMgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO40.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.51.6蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO40.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/LPH5.5-6.5 （发酵或种子培养基）★★1.7 MRS培养基（分离培养计数用）蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏 5.0g、柠檬酸氢二铵 2.0g、葡萄糖 20.0g、吐温 80 1.0mL、乙酸钠 5.0g、磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、蒸馏水1L, pH 6.5。
（分离培养基），当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。
1.8 BCP培养基（溴甲酚紫培养基）乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5℅溴甲酚紫10ml 自来水1000mlpH6.5-7.0 （分离用）1.9 BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。
另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
2.分离筛选：2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。
若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。
以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.2.2菌种分离纯化：溶钙圈法：富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12ml MRS培养基或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。
挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。
或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。
2.3性能测定：乳酸菌定性试验：不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃ 37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。
方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。
取滤纸一条，在含氨的硝酸银溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。
方法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。
产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。
醋酸量（g/100mL）= 氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3 /样品毫升数 x100同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。
3.菌株鉴定：3.1菌落形态：3.2菌体形态：（革兰氏染色观察）染色镜检：杆状阳性。
3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法3.4生理生化：3.3.1生化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐还原，产生吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。
3.3.2生理试验：乳酸菌产酸能力曲线：将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，25-32℃培养48h，间隔4-6h测定发酵液pH。
食盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培养基中，添加0.0℅ 2.0℅ 4.0℅ 6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培养基中，32℃培养48h，测定OD值。
溴甲酚绿指示剂法：原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分离培养基配制后PH为6.8，加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落周围变成黄色，较容易鉴别。
培养基：BCG牛乳营养琼脂初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初定为乳酸菌。
复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传代若干次培养，挑选出3-4h能凝固的乳管保存备用。
注：1.乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行：分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进行混菌划线或涂布培养（放厌氧袋），分别25℃ 37℃培养48h。
菌落观察：平板表面形成浅色（黄色或白色）小菌落。
麦芽汁碳酸钙培养基表面，菌落周围形成透明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫色的培养基形成黄色包围圈。
触酶反应：厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。
将各种特征菌落分别接入斜面，培养后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。
2.菌落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。
2.1菌落形态观察：乳白色边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。
个体形态：半透明细杆状链状排列，大量时呈发丝状堆积。
初步认为乳杆菌。
2.2生化鉴定：在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反应。
说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。
明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。
（过氧化氢酶还原硝酸盐）糖发酵试验：发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应，其余麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴性反应。
根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
（纤维二糖甘露醇山梨醇七叶苷水杨苷）2.3乳酸菌生长曲线pH-t测定结果：三.几种乳酸菌筛选举例1.嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基，培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离2.保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶，培养基：牛肉浸膏 1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖3.0％，柠檬酸三铵 0.2％，七水硫酸镁 0.02％，琼脂 1.5％，pH 5.1。
培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。
3.双歧杆菌：样品来源：婴儿新鲜粪便，培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、 PTYG培养基，培养温度：37℃，需氧情况：严格厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。