第二章 菌种分离筛选

刚果红染色法
• 常用的刚果红染色法有两种：一是先培养微生物，再加 入刚果红进行颜色反应，二是倒平板时就加刚果红。
• 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶 液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色 反应基本上是纤维素分解菌的作用。 • 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点 是由于实验材料和琼脂都含有淀粉类物质，可以使能够 产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀 粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊,无明显影响.方法二 的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们 在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈， 与纤维素分解菌不易区分。短时间培养也无大碍。
四、自然界中细菌的分离
(一)采样和采集方法
• 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的 细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域 中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。 • 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
微生物菌种分离实例
分解纤维素的微生物的分离
实验目的 • 从土壤中分离能分解纤维素的微生物,纯化得到1-5株菌. 并通过此次实验,培养以下三方面的能力: • 1.基本技术训练：在目前专业课程学习基础上进一步练习 培养基的配制，干湿热灭菌，以及微生物分离纯化技术。 • 2.初步的科研训练：练习科研过程中查阅资料、设计实验 方案、动手实施方案、综合安排实验、解决临时实际困 难等方面的基本能力，认识科研程序，感受科研乐趣和 困难。 • 3.培养实事求是的工作作风，科学严谨的工作态度。
实验原理
纤维素与纤维素酶 • 纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包含三部分， C1,Cx,和葡萄糖苷酶组成。前两种使纤维素分解成纤 维二糖，第三种将纤维二糖分解成葡萄糖，正是在这 三种酶的协同作用下，纤维素最终被分解成葡萄糖， 为微生物的生长提供营养。
• 纤维素分解菌的筛选 纤维素-刚果红混合培养基
放线菌菌落形态
六、真菌分离
1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落 分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利 用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制 真菌的迁徙生长。 2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分 离。 3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分 离培养时应加以考虑。
4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种 或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技 术。 富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变 来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如 以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富 集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。 5、在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地 抑制细菌生长及菌落形成。
放线菌的分离
• 土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎， 无菌海绵压印土样后压印平板后培养。 • 植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以 减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培 养。也可洗下微生物后振荡培养。 • 水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量 种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉 积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。
• 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离 了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生 变化，微生物群体之间就会出现消长
(二)生态学参数及培养基 的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境 生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶 剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。 2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取 物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几 丁质、纤维素或果胶。
筛
•
选
这一步是采用与生 产相近的培养基和培 养条件，通过三角瓶 的容量进行小型发酵 试验，以求得适合于 工业生产用菌种。
毒性试验
• 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定， 微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米 曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外， 其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒 性试验。
5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土 壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶； 6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸 出汁和培养条件； 7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法； 8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的 方法； 9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛 选意义的微生物类群。
用刚果红染色法鉴定筛选 降解纤维素的菌株
抗生素筛选
羧甲基纤维素钠作培养物
检定菌培养， 加上发酵液
五、放线菌的分离培养基的组成原则
• 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物 的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其 他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓 慢形成菌落。 • 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉 菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。 • 选择性地添加抗生素。 • 分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养 箱中存放3天。
• 二 根据微生物生理特点采样 1、根据微生物营养类型
2、根据微生物生理特性
• 三 特殊环境下采样
第三节 含微生物样品的富集培养
• 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性 培养基，选择一定的培养条件来控制。 一、控制培养基的成分 • 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那 么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长， 而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段 的纯种分离就会顺利得多。
三、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。 • 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所 需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性 包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工 艺等。
真菌的分离方法
• 土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法， 粘附法，，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。 • 植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗 涤法，浸泡法。 • 水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱 技术常用于水中真菌的富集。 • 子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体 组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一 小块无菌滤纸上培养。
第二节 分离样本的采样
一、采样对象以采集土壤为主。 • 一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细 菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土 壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一 些野果生长区和果园内。 • 采样的对象也可以是植物，腐败物品， 某些水域等。
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
菌种筛选主要步骤
• 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓
• 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 ↓ 生产性能试验 ↓→毒性试验 菌种鉴定
一、成功的分离培养方法
(1)认真考察所需产品的特征和生产过程； (2)制订初步的筛选标准；
(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。
三、将生态学方法用于培养分离 的一般思路要点
• 1．罗列出所要分离的微生物类群； • 2．根据所采集样本的各种生态参数，描述所要 分离的微生物之生态系统或栖息地： • 3．将若干样本分成若干类型，如植物和植物各 部，土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵 食品等； • 4．罗列出所要考察和测量的环境参数，如pH、 盐分、水分、氧化还原电势及温度等；
• 二、控制培养条件 pH值的控制 细菌、放线菌：pH 7.0～7.5 酵母菌、真菌：pH 4.5～6.0
温度的控制
通气量的控制
• 三 抑制不需要的菌类 如使用不同类型的抗生素、高温、 高压等条件，抑制不需要的菌类。
第四节 微生物的培养分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微 生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
次代培养及纯化
• 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异， 作初步的鉴定和区分。 • 通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子 形成情况。 • 成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是 所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而 肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定， 在分离放线菌时显得尤为重要。 • 将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的 钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行 影印培养，以进一步筛选和分离。
第六章 微生物菌种的分离筛选